灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血CD4CD8影响

正 文
第一部分 灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血CD4+/CD8+的影响的实验研究

[摘要] 目的：观察灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液（AHP）对大鼠进行肌肉注射以建立阳虚大鼠模型，比较运用灵龟八法开穴灸与穴位（足三里、肾俞）温和灸对模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+变化的影响。结果：灵龟八法开穴灸组和足三里、肾俞温和灸组模型大鼠与正常组大鼠外周血CD4+/CD8+比值变化无明显差异。结论：灵龟八法开穴灸法治疗阳虚模型模型大鼠，能明显增强大鼠外周血T淋巴细胞的免疫功能。
[关键词] 阳虚；灵龟八法；足三里；肾俞；T淋巴细胞亚群

根据中医学理论，阳虚证是指机体阳气虚衰、正气不足，从而表现出一系列机体功能衰退，代谢减弱的病理状态[1]。研究显示免疫系统功能低下属于阳虚的范畴。CD4+、CD8+是T淋巴细胞的亚群，CD4+与CD8+的比值是用于临床上重要的评估机体免疫系统功能状况的指标之一。大量临床实践表明灸法对治疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种按时开穴的方法是中医学整体观念的重要体现，能提高针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探讨灸法防治阳虚证的免疫学机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用SD大鼠50只，230g～280g（SPF级，武汉大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(鄂）2008-0004），雌雄兼用。
1.2 主要药品与试剂
醋酸泼尼松龙注射液（AHP)：125mg/5ml浙江仙琚制药股份有限公司（国药准字H33020824,生产批号120912）；艾灸条：南阳市绿佳艾绒厂；FITC（一硫氰酸荧光素）标记小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体、PE（藻红蛋白）标记小鼠抗大鼠CD8单克隆抗体、APC（别藻蓝蛋白）标记小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体：美国eBiscience公司产品；红细胞裂解液，武汉谷歌生物科技有限公司产品，货号：G-2015；胰酶Trypsin，Amresco公司产品，货号：0457；0.9%氯化钠注射液；1%肝素钠注射液；自配PPS液等。
1.3 主要仪器设备
FACsort流式细胞仪(美国BD公司）、飞鸽TD2SO-2H离心机（上海安亭公司）、SW-CJ-1FD洁净工作台（苏净安泰公司）等。
1.4 实验方法
1.4.1 阳虚大鼠模型的建立
选用SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准进行大腿外侧肌肉注射AHP，连续5天。大鼠出现身体蜷曲、背部拱起、蜷缩在一起、四肢尾冷、神情疲惫、被毛疏松、反应呆滞、毛色暗淡、身体消瘦、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发脱落等虚损症状[1]。根据中医八钢辩证之阳虚证，辨证参考标准[2]，模型大鼠所表现出的一系列体征与“阳虚”状态高度一致，说明此次试验所建立的阳虚大鼠动物模型属成功模型。
1.4.2 实验动物分组
将建立好的阳虚模型大鼠按随机数字表随机分组，建立好的阳虚模型大鼠不予干预视为阳性空白对照组(A组)，足三里、肾俞温和灸组(B组)，灵龟八法开穴灸组(C组)，灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组(D组)，正常大鼠视为阴性空白对照组(E组)，共5组，每组10只，雌雄分养。
1.4.3 治疗方法
B、C、D组大鼠每天每穴温和灸15分钟，左右交替进行，连续2周。灵龟八法开穴法依据《子午流注与灵龟八法临床应用盘》(魏晋盛主编，山西科学技术出版社，2010年10月，第一版)简易法选穴。A、E组大鼠只抓取，不做治疗。穴位定位：“足(后)三里”穴(双)，定位于后肢胫骨粗隆外膝至踝间上1/5处[10]；“肾俞”穴，定位，首先用手触摸到大鼠背部脊柱及两旁的肋骨，在肋骨结束的水平，定位第十二胸椎，然后往下数二个棘突，左右旁开1Omm(同身寸，大约为人体的1/10)即为“肾俞”穴[11]。灵龟八法开穴中涉及的其它穴位定位均通过查阅李辞蓉等编著的《大鼠针灸穴位图谱的研制》而定。
1.5 观察指标及检测方法
1.5.1血液标本
采用心脏采血法收集实验大鼠血液2ml快速放置在EDTA抗凝管中，以避免采集的标本发生溶血和凝血现象。将收集的血液放入离心机，进行3000转每分钟离心10分钟，并取上清液置于1.5mlEP管中，标记后放入-20℃冰箱中保存。在离心后的血液沉淀加入3ml1×红细胞裂解液，摇匀后静置15分钟。放入离心机进行1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液。次操作需重复两次。
1.5.2细胞标本
（1）将培养液收集于流式管中。
（2）六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1ml 0.25%胰酶消化细胞，
待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS缓冲液终止消化。用移
液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，进行每分钟1500
转离心5分钟，之后弃上清。加入3ml 4℃预冷的PBS缓冲液中重
新悬浮细胞，1500转/分钟离心5分钟，弃上清。
（4）沉淀加入100μl 4℃预冷的PBS重悬细胞。
（5）加入荧光标记的一抗2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。
（6）每分钟1500转离心5分钟，弃上清。
（7）加入3 ml PB重悬细胞，1500转离心5分钟，弃上清。
（8）沉淀加入100μl预冷的PBS，重悬细胞。
（9）加入荧光二抗2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。
（10）每分钟1500转离心5分钟弃上清，加入3ml PBS洗一次，加入100
μl PBS 重悬。样品上机，PI通道（FL2）检测红色荧光。
1.6 统计学方法
对各组计量资料进行方差分析，组间两两比较采用Lsd-t检验。以上统计分析运用SPSS 19.0统计软件完成。
2 结果
五组大鼠试验结果见表1。
表1 各组大鼠T淋巴细胞亚群变化比较(±S)
组别 n CD4+ CD8+ CD4+/CD8+

　　　A组 10 24.52±2.27 30.50±2.29 0.81±0.90
　　　B组 10 33.38±2.71△ 26.34±2.37△ 1.30±0.77△
　　　C组 10 33.17±3.19△ 26.46±2.14△ 1.26±0.14△
　　　D组 10 38.88±2.85△，□ 23.54±2.37△，□ 1.66±0.14△，□
　　　E组 10 39.57±2.43△，□ 23.54±2.23△，□ 1.68±0.12△，□

注：△与A组比较，差异具有统计学意义（P<0.01）；□与B、C组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。3 讨论 中医学认为，阳虚即是阳气虚衰的病理现象。阳气具有温煦、推动、调控、固摄等作用。如果阳气不足，临床上主要表现为畏寒肢冷，四肢不温，完谷不化，精神不振等症状。本实验用免疫抑制剂醋酸泼尼松龙注射液造成的“阳虚”模型，可见大鼠出现拱背、蜷曲、肢尾冷、挤卧在一起、神疲、反应迟钝、被毛疏松、失去光泽、消瘦、少食、畏寒、精神不振、脱毛、便溏等虚损症状。此模型与邝氏等报道的一致[12]。因此此模型属于可靠的大鼠阳虚证模型。 大量文献表明，阳虚证与机体免疫功能低下有关[13-19]。T细胞亚群是目前临床上运用最为广泛的反映免疫功能状态的指标。T淋巴细胞主要分为两大亚群它们分别是CD4+, CD8+ 。这两大压群因CD抗原的不同在免疫应答中分别行使着不用的功能。CD4+T细胞亚群又分为诱导性T细胞(Ti)和辅助性T细胞(Th)。而CD8+按其结构和功能的不同，可被分为细胞毒性T细胞（Tc）和抑制性T细胞（Ts）。通过试验及临床发现，Th/Ts比值是相对恒定的，这对于保持机体免疫稳态、合理调控机体的免疫应答有着重大的意义，这同时也是体现机体免疫系统内环境稳态的一个很好体现。机体在健康的状况下，亚群之间是通过互相协作和相互拮抗来达到一个动态的平衡的。而当Th与Ts的比值的相对平衡被打破时，则可导致机体免疫功能低下、紊乱从而导致疾病。有学者认为CD4+/CD8+比值的相对恒定可能是中医理论体系中所说的“正气存内，邪不可干”理论的物质基础之一[20]。因此CD4+/CD8+对研究机体免疫应答和免疫调节具有重要意义。 针灸科临床上常常使用足三里穴、肾俞穴艾灸治疗、调整阳虚证患者。足三里穴始载于《内经》，仅在《灵枢》中有关其主治运用的记载即达15处之多。随着针灸学理论的不断完善与发展，足三里穴的诸多功效也被人们逐一发现，历代医籍对其主治记载也十分之多，《古法新解会元针灸学》曰：“此穴治病万端，有白术之强，有桂附之热，有参茸之功，有硝黄之力”，故而成为临床常用要穴，历来就被推崇为补虚培元之要穴。”有临床与动物实验显示，刺激足三里能调节下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）从而使机体紊乱的功能趋于正常[21]。肾藏精，生髓。肾俞穴系肾在背部之输穴，位于十四椎之旁，穴近肾脏而内应肾，是肾气转输、输注之所，为治肾之要穴，有益肾填腰、固精补虚、壮阳利湿、健脑明目之功，临床常用于治疗由肾虚(包括肾阳虚)引起的各种病症。 灵龟八法是祖国医学中一种具有其独特特色的一种治疗方法，它历史悠久，其按时选穴的理论也充分的体现了祖国医学中“天人和一”的核心思想。近年来在运用现代医学理论方法探讨研究灵龟八法作用于机体的作用机制领域有了较大的发展。灵龟八法按时开穴，取用与奇经八脉相通的8个穴位，是中医学整体观念的重要体现，故能提高针灸临床疗效。 本次5组大鼠的T细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+数值检测结果表明，足三里、肾俞温和灸组、灵龟八法开穴灸组、灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组均能显著提高外周血T淋巴细胞免疫功能。在阳虚大鼠 T淋巴细胞亚群CD4+、 CD4+/CD8+数值变化影响方面, 灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组比前两组（B组、C组）效果更加显著（P<0.01）,使CD4+、CD4+/CD8+数值升高,而使 CD8+数值下降。第二部分 灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血细胞因子IL-2影响的 实验研究[摘要] 目的：观察灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血细胞因子IL-2的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液（AHP）对大鼠进行肌肉注射以建立阳虚大鼠模型，比较运用灵龟八法开穴灸与穴位（足三里、肾俞）温和灸对模型大鼠外周血细胞因子IL-2变化的影响。结果：灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组模型大鼠与阴性空白对照组大鼠外周血细胞细胞因子IL-2变化无明显差异。结论：灵龟八法开穴灸法可以提高阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞的免疫功能。[关键词] 阳虚模型；龟八法；足三里；肾俞；细胞因子。 研究显示免疫系统功能低下属于阳虚的范畴[13-19]。外周血白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2)水平在临床应用中已是反映机体免疫系统功能状况的重要指标。大量临床实践表明灸法对治疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种按时开穴的方法是中医学整体观念的重要体现，能提高针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探讨灸法防治阳虚证的免疫学机理。1 材料与方法1.1 实验动物 选用SD大鼠50只，230g～280g（SPF级，武汉大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(鄂）2008-0004），雌雄兼用。1.2 主要药品与试剂 Rat Il-2 Elisa kit货号为ERC001欣博盛公司；醋酸泼尼松龙注射液（AHP)：125mg/5ml浙江仙琚制药股份有限公司（国药准字H33020824,生产批号120912）；艾灸条：南阳市绿佳艾绒厂；0.9%氯化钠注射液；1%肝素钠注射液等。1.3 主要仪器设备 RT-2100C酶标仪（美国雷杜公司）；AJC-0501-P纯水仪(艾科浦公司）、TGL-16C台式离心机（上海安亭公司）、WH-2微型漩涡混合器（江苏新航仪器厂）；TL-420D水浴锅（天力医疗器械有限公司)等。1.4 实验方法1.4.1 阳虚大鼠模型的建立 选用SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准进行大腿外侧肌肉注射AHP，连续5天。大鼠出现身体蜷曲、背部拱起、四肢尾冷、蜷缩成团、神情疲惫、反应呆滞、被毛疏松、毛色暗淡、身体消瘦、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发脱落等虚损症状[1]。根据中医八钢辩证之阳虚证，辨证参考标准[2]，类似“阳虚”状态，说明此次试验所建立的阳虚大鼠动物模型属成功模型。 1.4.2 实验动物分组 将建立好的阳虚模型大鼠按随机数字表随机分组，建立好的阳虚模型大鼠不予干预视为阳性空白对照组(A组)，足三里、肾俞温和灸组(B组)，灵龟八法开穴灸组(C组)，灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组(D组)，正常大鼠视为阴性空白对照组(E组)，共5组，每组10只，雌雄分养。结 语 免疫系统对于机体正常发挥其生理功能起着至关重要的作用。以往研究发现，阳虚证与机体免疫系统功能低下有着密切的联系[26]。阳虚证患者往往表现为肢冷畏寒、大便溏泄、小便频数、精神萎靡，在男性也表现为阳萎早泄、性欲低下；在女性可表现为宫冷不孕、月经稀少、清稀。虽然阳虚证对患者生命无碍，但却大大的影响了患者的生活治疗。临床上所见阳虚证多以脾阳虚与肾阳虚证多见。在治疗上也多用以温阳药进行治疗，如：附子、肉桂、干姜等。虽然在临床效果上，可见不俗的成效，但治疗方法较单一，同时关于中药的煎制、成本以及药物带来的副作用对于也给患者带来了一定的经济负担和身体伤害。因此对于丰富临床治疗阳虚证的新方法是十分必要的。　　　本实验通过对肌肉注射醋酸泼尼松龙注射液造成阳虚大鼠模型进行研究，运用灵龟八法开穴灸与穴位（足三里、肾俞）温和灸对模型大鼠进行治疗，探讨外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+以及细胞因子IL-2变化的影响。发现灵龟八法开穴灸、足三里、肾俞温和灸、灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸均可提高阳虚大鼠外周血细胞因子IL-2水平和周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+，从而提高阳虚大鼠免疫力。其中灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸效果最为显著。说明灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸能最大的提升艾灸的功效。　　　随着人类生活水平的不断提高，人们越来越注重自己的生活质量。艾灸疗法是一种操作简便易行，价格低廉，无副作用并且效果显著的治疗方法。从古就一直被用于治病与保健方面。本实验通过艾灸对模型大鼠进行治疗，发现不仅在免疫指标方面，各项指标都有明显的改善，同时，通过艾灸治疗的大鼠模型在体征上也逐渐接近于正常对照组大鼠。本次试验也提示，在临床上，如果运用中药治疗阳虚证的同时，加以艾灸疗法进行辅助治疗，疗效会更加的确切。因此对于更好的治疗阳虚证，提高机体免疫功能，此方法有着广阔的前景和深远的意义。