双氟核苷类药物中间体的合成研究

摘 要
吉西他滨等双氟取代类药物是核苷类药物中重要的组成部分，本课题应用现代研究手段，以2-脱氧-2，2-二氟-3，5-二苯甲酰基-D-呋喃核糖为原料，通过磷酸法、非均相磷酸化法、五氧化二磷法三种不同的合成方法合成目标核苷药物中间体，并对合成工艺进行了优化研究，筛选出适合的合成方法。试验结果如下：一、以磷酸作为磷酸化试剂，与原料核糖合成了2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖-1-磷酸酯，通过高效液相色谱(HPLC)作出原料的浓度标准曲线和线性方程，用来计算反应物的转化率。合成工艺的优化条件为：反应温度80℃，反应时间3h，溶剂乙腈容量为15ml，磷酸用量为0.57ml。通过磷酸化法得到的最高转化率为14.2%，转化率较低。二、以磷酸和五氧化二磷制备的非均相磷酸化试剂作为磷酸化试剂，与原料核糖经过一系列反应生成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖-1-磷酸酯，合成工艺的优化条件为：反应温度70℃，反应时间3h，投料量2.1mmol，水解水用量为3.5mmol。通过非均相磷酸化试剂法得到的最高转化率为27.6%，转化率不高。三、以五氧化二磷为磷酸化试剂，与原料核糖合成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖-1-磷酸酯钾盐，通过单因素试验得到的优化条件为：五氧化二磷与四氯化碳溶液的液质比为3ml/g，原料的摩尔比n（核糖）：n（五氧化二磷）=1:0.75，反应温度55℃，反应时间2h，水解水用量为总物料量的5%，水解反应时间2h，水解反应温度为40℃。在单因素实验基础上，对原料n（核糖）：n(磷酸化剂)摩尔比,磷酸化反应温度，磷酸化反应时间，水解水用量占总物料量的比例进行了四因素三水平的正交实验，得到了优化的反应条件：n（核糖）：n(磷酸化剂)=1:0.75，磷酸化反应温度为55℃，磷酸化反应时间2.5小时，水解反应水量为总物料量的5%。针对优化后的条件作了两组平行试验，得到平均转化率为61.5%。转化率较高。四、针对羟基脱保护过程进行了研究，得到的优化条件为：甲醇-四氢呋喃的用量为9ml，前期氨水用量为6ml，前期反应时间2h，后期氨水用量为12ml，后期反应时间为9h。产率最高可达81.3%。五、用红外光谱分别对磷酸化产物和脱保护产物进行了鉴定，证明了磷酸化反应和脱保护反应的发生。综上所述，可以选用五氧化二磷作为合成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖1-磷酸酯的磷酸化试剂，经红外光谱鉴定后，可以确定合成的物质为目标产物。
第一章 文献综述
1.1 核苷类药物的概况
核苷类化合物是一种可以用来治疗疾病的化学类药物，它在药物市场中的地位十分重要，这类药物的数量与日俱增。核苷似物一般是非天然核苷，这种核苷类似物与天然核苷等物质在化学分子结构中有一定得相似的地方，正因如此，这类药物在体内才可以达到以假乱真的效果，不仅可以对体内的核酸的代谢过程进行干扰，而且可以直接作用于核酸的代谢过程，从而阻断核酸、蛋白质等物质的生物合成，因此这类药物在抗病毒、抗肿瘤等应用于化疗药物中占有十分重要的位置，在此类药物中占有很大比例，在今年的药物研究进程中，发展速度很快。核苷类似物一般为嘌呤类核苷类似物（氯法拉滨、氟达拉滨、安妥明、克拉屈滨等）和嘧啶类核苷类似物（吉西他滨，阿糖胞苷等），它是一类高效的抗代谢药，一般具有相似化学结构和和相近的作用机制。
1.1.1核苷类化合物的结构特点
核苷类化合物由于其独特的结构特点和作用机制，逐渐受到各类医药厂商和科学家们的欢迎，这种现象存在其必然性。核苷类化合物从化学结构的角度来看，主要是由碱基和糖基组成的。病毒一般情况下寄生于细胞中，它的繁殖依赖于寄生细胞，它的繁殖过程就是细胞的代谢过程，细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)的遗传信息是由组成DNA链的核苷的序列表达，核苷是核酸的一种基本组成成分，其参与了生物体内基因信息的保留、转录和复制。核苷类物质是细胞中一种重要的组成物质，在当今医药领域中，一种有效的抑制肿瘤细胞的生长和病毒的繁殖的手段便是以核苷类似物作为的治疗方法。在抗病毒繁殖和抗肿瘤的领域中大量的核苷类化合物被大量的开发和应用，主要的研究方向为对核苷的核糖基团或碱基进行定向改造，在核苷化合物分子上引入特定的活性基团，使这些核苷与体内的核苷存在相异性，对于底物方面的识别能力，人体自身的酶系统要优于病毒，因此，人体细胞会对特定引入体内的核苷类似物的底物起到识别作用，而病毒仅仅具有较差的识别能力，这些被引入到人体内的核苷基团自然会参与到病毒的繁殖代谢过程中，在病毒繁殖的某一重要阶段中起到阻碍作用，进而使病毒的繁殖得到控制，起到治疗疾病的作用。
1.1.2 核苷类药物的合成和生产概况
核苷是存在与生物体内的遗传信息物质，传统上是来源于天然生物体内，但是由于提取天然生物体内的核苷或核苷酸效率较低，提取步骤复杂，原料来源受自然资源的影响，某些核苷的分离过程存在困难，高昂的成本导致了天然提取核苷类物质价格较高，应用受到了限制。因而，人们开始用其他方法对核苷进行合成。
（1）化学合成法
化学合成法合成核苷类物质主要包括的三种方法为：传统合成法，半合成法和全合成法。
传统合成法的方法是将碱基和糖基分别进行合成，然后用特定的方法把糖基与碱基结合起来。1961年，Toshisada S. 等人以四乙酰基核糖及2，6-二氯嘌呤为原料，在高温催化下与甲苯磺酸反应得到2’，3’ ，5’-三乙酰-2，6-二氯嘌呤核苷，如图1.1所示：
高温及催化作用下，不同的保护的核糖与嘌呤碱基，可以得到特定结构的嘌呤核苷。但是传统合成法由于转化率较低，分离困难，成本较高，因此不适用于工业生产。
半合成法的原料一般为天然核苷类物质，采用特定的化学方法对其结构进行改造，例如利用胞嘧啶核苷生产阿糖胞苷（如图1.2）。半合成法由于原料的价格与来源及产品的分离操作问题限制了工业生产的发展。
全合成法的原料一般为特定构型的糖，可以利用噁唑啉为中间体来合成碱基部分，以碘苷的合成路线为例（如图1.3）可以了解这一合成方法。这种方法的特点是立体选择性好，合成步骤少，转化率较高。
（2）生物转化法
目前，生物催化转化技术的显著特点是这种技术具有比较温和的反应条件，合成的专一性很高以及副反应较少等的特点，在各种类型的合成反应中应用十分广泛。生物转化法合成核苷类似物需要用到酶催化，这些酶大体分为两类：核苷磷酸化酶，N-（脱氧）核糖转移酶。核苷磷酸化酶培养菌主要有欧文杆菌、乙酰短杆菌、大肠杆菌、干燥棒杆菌、佐氏库特氏菌；核糖转移酶产生菌主要有莱氏乳细菌、瑞士乳酸杆菌和大肠杆菌。核苷磷酸化酶催化合成核苷主要经过两步反应，而这两步反应均为可逆的，在合成过程中，由于受到核糖基团和碱基对酶亲和性大小的影响，亲和性越强，反应的转化率也就越高。N-脱氧核糖转移酶立体专一性较高，只能催化合成β型核苷。生物转化法也存在着如菌种筛选困难，转化酶对底物有严格的选择性，及成本高等缺点。
（3）化学-生物转化合成法
化学-生物转化合成法是将核苷的化学合成法与生物转化法有机的结合起来，这对于核苷类物质的合成有着重要意义，这种方法克服了一些化学合成法和生物转化法各自合成中遇到的缺点和难题。正是由于这种方法的发展，工业上已可以对鸟苷、肌苷等进行大规模的生产，化学-生物转化合成法对核苷类抗生素的合成起了十分重要的推进作用。目前，多种核苷类药物已经应用这种方法被生产出来。化学-生物转化合成法的最突出的优势是生产成本较低，可以实现大规模生产，原料易得，正因如此核苷类药物的价格逐渐降低。但是这种方法的缺点是利用这种方法，通常只能生产天然存在的核苷，与核苷类物质多样性的需求相冲突。
国外核苷类药物的开发和研究始于上世纪40年代末，发展至今，世界各大制药公司已经均有自己的生产和加工核苷类药物车间，各类核苷类药物源源不断的投入到疾病治疗工作中。近年来，各大药物公司意识到未来核苷类药物的重要性，不断对核苷类药物加大投资。亚洲各国，如日本、韩国、印度等一些国家在核苷类药物的开发和研究方面都比我国相对要早，其中，亚洲最早进行核苷类药物研发的国家是日本，日本的武田、住友等公司都已经建立起了核苷类药物及其中间体的开发研究和生产基地。我国对核苷类化合物及其中间体的研究始于上世纪90年代末，起步较晚，正因如此，我国在核苷化合物及中间体的自主研发方面较为落后，种类较少，并且部分原料依然需要依赖进口，这同样使我国核苷类药物研究进展相对比较缓慢，这种情况与核苷类药物的巨大需求与生命科学的快速发展都是极不协调的。
1.1.3 核苷类药物的应用
核苷类化合物主要应用方向是医药方面，不仅新药在源源不断的推出，而且应用范围也在不断的被扩大。
①抗病毒药物。病毒是一种个体十分微小，结构非常简单的一种病原微生物，传播性很高。核苷类药物对病毒的作用机理是它能够对病毒复制某一过程进行选择性的干扰，从而宿主细胞免于被病毒所感染，进而达到治疗疾病的目的。核苷类抗病毒药物不仅品种繁多，而且结构多样，主要集中应用对艾滋病病毒（HIV）、肝炎病毒（HBV）、疱疹病毒（HSV）及埃博拉病毒（EBOV）等的感染予以治疗。由于艾滋病病毒感染病人往往伴随着其他病毒的感染，如水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒等，因此，治疗在对艾滋病病毒感染治疗的的同时也要适当的配合使用对抗这些病毒的药物，这样就对抗病毒药物的发展又起到了积极的推动作用。图1.4列举几个核苷类抗病毒药物的的分子式：
阿昔洛韦是最早用于抗病毒的药物之一，于1977年问世，它的问世标志着抗病毒核苷类药物市场的起步，阿昔洛韦具有简单的制备方法，它的结构为无环鸟苷，是治疗疱疹病毒的首选药物。恩曲他滨是拉米夫定通过氟取代生成的一种核苷类似物，于2003年上市，能很好地抑制艾滋病病毒和乙型肝炎病毒，是一种高效的核苷类抗逆转录酶药物。恩替卡韦于2005年上市，是一种碳环核苷类类似物，具有极强的抗乙肝病毒的功能，通过口服进入人体的肝细胞后，可以形成三磷酸酯，进而可以通过对乙肝病毒DNA聚合酶的活性进行抑制，达到治疗疾病的效果。

第六章 结 论
本课题研究了以2-脱氧-2,2-二氟-3，5-二苯甲酰基-D-呋喃核糖为原料，分别用三中磷酸化试剂对原料进行磷酸化反应，制备出了F,F-BzAP，取得了以下结论：
1.以磷酸作为磷酸化试剂，与2-脱氧-2,2-二氟-3，5-二苯甲酰基-D-呋喃核糖经过一系列反应生成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖1-磷酸酯，通过高效液相色谱作出原料的浓度标准曲线和线性方程，用来计算反应物的转化率。经过试验得到的最佳反应条件为：反应温度80℃，反应时间3h，溶剂乙腈容量为15ml，磷酸用量为0.57ml。通过高效液相色谱测定后，得到最高转化率为14.2%。这一转化率不能满足对于这个磷酸化反应的转化率期望，因此需要通过其他磷酸化方法获得更加理想的反应条件。
2.以磷酸和五氧化二磷制备的一种非均相磷酸化剂作为磷酸化试剂，与2-脱氧-2,2-二氟-3，5-二苯甲酰基-D-呋喃核糖经过一系列反应生成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖1-磷酸酯，最佳反应条件为：反应温度70℃，反应时间3h，投料量2.1mmo，水解水用量为3.5mmol。通过高效液相色谱测定后，得到最高转化率为27.6%。这一方法产生磷酸酯的转化率有所升高，但是总体来说，转化率仍然较低，还需要寻找更加高效的磷酸化试剂。
3.以五氧化二磷为磷酸化试剂，采用溶剂法将五氧化二磷分散在反应体系中，与2-脱氧-2,2-二氟-3，5-二苯甲酰基-D-呋喃核糖经过一系列反应生成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖1-磷酸酯钾盐，进行了单因素试验，得到了优化条件：五氧化二磷与四氯化碳溶液的液质比为3ml/g,原料的摩尔比n（核糖）：n（五氧化二磷）=1:0.75，反应温度55℃，反应时间2h，水解水用量为总物料量的5%，水解反应时间2h，水解反应温度为40℃。同时对反应温度等4个条件做了正交实验，得到了优化的反应条件：n（核糖）：n(磷酸化剂)=1:0.75，磷酸化反应温度为55℃，磷酸化反应时间2.5小时，水解反应水量为总物料量的5%。最终得到的产物的平均转化率为61.5%。用柱色谱对产物进行提纯，提纯后的产物进行了红外光谱的分析鉴定，得出合成的产物即为目标产物。五氧化二磷可以作为合成2-脱氧-2,2-二氟-D-呋喃核糖1-磷酸酯钾盐的磷酸化试剂，反应转化率较高。
4. 对脱保护过程的五个影响因素进行了优化，得到的优化条件为：甲醇-四氢呋喃的用量为9ml，前期氨水用量为6ml，前期反应时间2h，后期氨水用量为12ml，后期反应时间为9h。转化率最高可达81.3%。同时对脱保护后的产率进行了重结晶实验，得到较为纯净的终产物。对产物进行了红外光谱的鉴定，在与原料和磷酸化产物的红外光谱对比后得出，苯甲酰基已被脱除，合成产物为目的产物（F,F-(AP)K）。