间充质干细胞在伊马替尼耐药中的作用研究

摘 要

背景：伊马替尼治疗无效的慢性粒细胞白血病已被归因于静默白血病干细胞对伊马替尼无效。通过保护恶性祖细胞增殖和自我更新的功能，骨髓间充质干细胞可能导致了白血病的持续存在和进展。
方法:
从临床缺铁性贫血非白血病患者获取骨髓，以密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法提取MSC；从慢粒慢性期病人取骨髓，在Ficoll 淋巴细胞分离液中离心获得慢粒单个核细胞；用免疫磁珠法分离CD34+慢粒祖细胞；以流式细胞术对上述细胞进行特性鉴定。慢粒细胞和人间充质干细胞共培养或慢粒细胞单独培养，加入1µM或5µM伊马替尼，用碘化丙啶染色锚定蛋白V双重染色定量（PI-Anexin V）测定伊马替尼诱导的细胞死亡率。用Western-blot法评价Bcl-XL和Bax蛋白在伊马替尼诱导凋亡中的保护作用。用定量迁移实验评价MSC对原代慢粒细胞的趋化功能。
结果：
成功分离出MSC及原代慢粒细胞，所获取MSC纯度>95％；CD34+细胞纯度>95％。伊马替尼诱导原代慢粒细胞凋亡具有剂量依赖性，与间充质干细胞共培养，保护了慢粒细胞。与间充质干细胞共培养，在伊马替尼浓度为1µM时，慢粒细胞死亡率从43.4±4.5降至26.9±6.1％，在伊马替尼浓度为5µM时，慢粒细胞死亡率从76.8±6.3降至56.5±5.0％。Western-blot测定表明，间充质干细胞升高了抗凋亡蛋白Bcl XL的表达约5～6倍。MSC上清液对原代慢粒细胞具有化学诱导活性，10.7 ±3.2%的原代慢粒细胞移向未稀释的上清液，迁移也是浓度依赖性的。
结论：
人间充质干细胞保护伊马替尼诱导的慢粒细胞凋亡。可能与升高了抗凋亡蛋白Bcl XL的表达有关。MSC上清液对原代慢粒细胞具有浓度依赖性的化学诱导活性

关键词:间充质干细胞；伊马替尼；耐药

前 言

慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）简称慢粒，是起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，目前认为其发病是9号和22号染色体间相互易位导致，9号染色体的abl原癌基因片段与22号染色体的bcr片段融合产生bcr／abl基因，编码酪氨酸激酶活性成分，干扰细胞信号传导通路而导致肿瘤发生。以前的治疗多以羟基脲为主，甲磺酸伊马替尼（Imatinib）问世后成为了慢粒治疗的首选药物。伊马替尼能竞争性地抑制酪氨酸激酶与ATP结合，阻止酪氨酸激酶活化，起到了靶向治疗的作用，使相当高比例的病人获得了持久的缓解，从而改变了慢性粒细胞白血病的治疗[1]。然而，大多数的患者最终还是会复发，其原因为低水平的残余病变。其中慢粒慢性期患者大约4％对伊马替尼存在原发耐药，而加速期及急变期耐药高达40％和90％左右[2]。伊马替尼对慢粒的治疗作用点并非肿瘤干细胞。在原代Lin–CD34+CD38–慢粒细胞中处于静止期的BCR/ABL阳性的白血病干细胞是可以被检测到的[3]，在伊马替尼治疗后仍然存活[3-6]。

综述

骨髓间充质干细胞的特性及临床应用进展

1867年，德国病理学家Cohnheimt发现骨髓内存在非造血功能的干细胞，1976年，Friedenstein和Petrakova成功分离、培养出骨髓间充质干细胞，并证实其具有多向分化潜能[1]。1991年Caplan将其定义为骨髓间充质干细胞[2]。
间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞，具有自我复制、自我更新及多向分化能力，除骨髓外，广泛分布于各种组织中。但因骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)最容易获取,是目前研究的热点。在特定的条件下，间充质干细胞可被诱导分化为骨髓基质细胞、成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞、肝细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等[3],MSCs的这种强大的分化潜能使得它在临床上越来越受到关注,目前MSCs已成功应用于心血管疾病、神经系统疾病、骨及软骨疾病等领域[4]。MSCs对造血干细胞起空间位置的机械支持作用，同时还分泌多种生长因子，对HSCs的自我更新及造血分化具有支持作用，有助于维持HSCs的未分化状态,并在HSCs的粘附和归巢中起重要作用。此外， MSCs对血液系统疾病的发生、发展起重要的作用。

1.骨髓间充质干细胞的分离
间充质干细胞存在于全身结缔组织和器官间质，甚至在胎盘绒毛和羊水中也有MSCs，相对来说以骨髓组织含量最高。骨髓组织中MSCs的含量也很少，约占骨髓单个核细胞的1/104～1/105，但其扩增能力很强，Pittenger等对MSCs的分离、培养、扩增在1999的文章中做了详细报道[3]。
成年人的骨髓间充质干细胞都是从骨盆髂骨中抽取，也可从胫骨、股骨、脊椎中获得。目前对骨髓骨髓间充质干细胞的分离、纯化主要有 5 种方法，包括贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠法,特制培养板筛选法、流式细胞仪分离法[5]。1）贴壁分离筛选法也称全骨髓贴壁培养法，是根据 MSCs 贴壁生长而造血干细胞悬浮生长的特性对两者进行分离。抽取骨髓后直接加入培养液制成细胞悬液，以合适的细胞浓度进行培养，早期造血细胞成分多，随时间造血细胞坏死，随换液而不断清除，培养皿表面包被细胞外基质成分如明胶等可促进MSCs 贴壁，并得以纯化。但所得细胞成分复杂，MSCs 的纯度不足。2）密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞密度不同而采用淋巴细胞分离液将骨髓间充质干细胞分离出来, 再在培养瓶中培养，通过换培养基除去悬浮细胞，得到的细胞纯度达95％。操作快速, 对细胞的活性影响较小。3）免疫磁珠分离法即利用MSCs的细胞表面抗原与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在磁场作用下分离细胞。4）特制培养板筛选法主要是根据细胞大小进行分离,即利用一种有3μm小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选MSCs,其均质性>98%。5）流式细胞仪分离法根据MSCs的细胞表面标记,利用相应的荧光素标记抗体进行筛选。纯度高, 但细胞活性损失较大。故采用贴壁与密度梯度离心相结合,操作快速,对细胞的活性影响较小并每次传代严格掌握消化酶的量和消化时间, 保证骨髓间充质干细胞在短暂的作用时间内与培养瓶底分开, 淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附与瓶底, 从而使骨髓间充质干细胞得到纯化。
骨髓间充质干细胞体外培养呈成纤维样集落形成单位，贴壁生长。采用全骨髓培养法，刚贴壁的细胞呈圆形、纺锤形或梭形，胞核居中，有2个以上核。之后细胞增大，克隆形成并有突起，部分细胞呈三角形或多角形。体外增殖迅速，生长状态稳定，而且随着换液次数和传代次数的不断增加，细胞纯度不断增加，均质性不断提高，细胞呈均匀有序的成纤维细胞样。
2.骨髓间充质干细胞的表面标志
间充质干细胞表达很多表面标志，但并不是单一的，兼有间充质、内皮和肌肉细胞的特征，包括粘附因子、生长因子、细胞因子、受体和整合素。但还没有发现MSCs独特的表面标志。
目前MSCs表面标记大体可分为以下几类[6-9]：1）粘附分子：整合素- αVβ3、整合素- αVβ5、整合素链α1～α5、整合素β1～β5、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、LAF-3、ALCAM-1、L-选择素、内皮素、CD44；2）细胞因子及生长因子IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL15、LIF、SCF、Flt-3配体、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；3）细胞因子及生长因子受体：IL-1R、IL-7R、IL-4R、IL-6R、LIFR、SCFR、G-CSFR、IFNR、TNF-ⅠR、TNF-ⅡR、TGF-β1R、TGF-β2R、BFGFR、PDFGR、EGFR；4）相对特异性抗原：SH2、SH3、SH4、STRO-1、α-平滑肌肌动蛋白、MAB1740；5）细胞外基质：胶原Ⅰ～Ⅳ型、蛋白聚糖、纤维结合素、透明质酸聚糖。
骨髓间充质干细胞与造血干细胞共同存在于骨髓中,不表达典型造血细胞表面抗原CD34、CD38、CD45、CD14等[10]，而只表达 CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等表面标志。部分研究检测到成纤维细胞和内皮细胞的抗原标志，可能与标本来源、细胞传代次数及培养调节不同有关。组织来源、分离培养方法及种属的不同，间充质干细胞的标志物也有所不同。且间充质干细胞所表达的这些抗原，在其他类型的细胞中也有表达，并没有特异性，这就使其研究、应用存在很大障碍。我们在实际培养出的细胞不一定纯净，有报道称表达CD45和CD11b的B细胞祖细胞、粒系和单核细胞祖细胞会一直存在于培养过程中。

3.间充质干细胞的鉴定
由于MSCs表面标志的非特异性，对于MSCs的鉴定还没有较好的办法，Dominici M于2006年发表了关于人MSCs鉴定的最低标准[11]，包括三个方面的内容：1）在标准的培养条件下MSCs能贴塑料瓶壁生长；2）MSCs能表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19、及HLA-DR表面分子；3）MSCs在体外能向骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。
4.间充质干细胞的分化潜能[12-13]
骨髓间充质干细胞在一定诱导条件下具有向中胚层细胞分化的能力，如分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞等，还具有向外胚层的神经元细胞及内胚层的肝卵圆细胞分化的能力。
1)向骨细胞分化
用抗坏血酸、β-磷酸甘油、地塞米松孵育混合生长的单层间充质干细胞2-3周，间充质干细胞形成集落，其碱性磷酸酶表达增高，随时间发生钙蓄积。
2)向脂肪细胞分化
与地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤孵育，可诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。细胞内脂肪泡蓄积，最终脂肪泡融合并填满细胞，形成脂肪细胞。
3)向肌细胞分化
5-Azacytidine可诱导间充质干细胞向胚胎和成年肌细胞分化。
4)向神经样细胞分化
小鼠间充质干细胞来源的成骨细胞和间充质干细胞自身在神经生长因子和5-氮胞苷的作用小，分化为神经细胞，表达成熟神经元的特异标志，但这些神经样细胞缺乏产生动作电位的电压门控通道。
5)向软骨细胞分化
在三维培养模式下，在无血清营养培养基加入TGF-β成分，间充质干细胞会向软骨细胞分化。
5.间充质干细胞的免疫性特性
MSCs表达低水平主要组织相容性复合物Ⅱ类分子和Fas配体，不表达与人类白细胞抗原识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物Ⅰ类分子，因而不能识别异体基因抗原，并且因缺乏免疫激活信号传导中两条共刺激通道，而导致免疫耐受，故MSCs是一种免疫缺陷细胞，研究表面异基因MSCs移植不存在HLA屏障[14]，从而为MSCs广泛用于造血干细胞移植提供了分子基础。骨髓MSCs除具有低免疫原性及可移植性外，还具有免疫调节特性[15-16]。MSCs对T淋巴细胞增殖反应的抑制作用与MSCs的数量有关。研究表明MSCs可通过多种途径发挥其对机体免疫细胞生物活性的调节作用，MSCs能抑制混合淋巴细胞反应中或植物血凝素刺激引起的T淋巴细胞的增殖，且这种抑制效应是剂量依赖性大，MSCs数量越大，其抑制作用越强，但少量的MSCs可增强T细胞的增殖能力，其表面抗原与HLA-DR抗原协同增强。Agganwal等将人MSCs和无关供者来源的骨髓单个核细胞共培养，发现调节性T细胞比例增高，而Treg细胞具有潜在的免疫调节作用，可阻止GVHD的发生，故MSCs可通过提高Treg细胞而诱导免疫耐受。
6.骨髓间充质干细胞在血液病中的应用
1）骨髓MSCs在血液病的发生、发展中的作用
MSCs能分化成骨髓微环境中的各种细胞成分并分泌多种细胞因子，与造血细胞之间相互作用，对血液疾病的发展起了重要的作用。近年的研究发现，MSCs在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，骨髓基质细胞能抑制化疗药物所致的白血病细胞凋亡[17]，对白血病细胞起保护作用，可能是因为MSCs使白血病细胞阻滞于G0/G1期，抑制了白血病细胞的自然增殖，从而使白血病细胞得到保护，与化疗药物耐药有一定关系。
传统认为，慢性粒细胞性白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，但有研究者[18]从CML源骨髓中分离出Flk-1+MSCs，其能在单细胞水平分化为CML细胞，将其移植入小鼠体内后，小鼠体内可检测到BCR/ABL基因，说明该群细胞可能作为CML肿瘤干细胞参与了疾病的发生。
再生障碍性贫血的发病也可能与MSCs的异常相关[19-20]。AA-MSCs与正常MSCs在形态学和免疫表型上一致，但前者的生物学特性有所不同。研究发现有以下特点：①AA-MSCs体外增殖能力减弱；②其抑制MLR和植物血凝素诱导T细胞增殖的能力明显降低；③抑制T细胞活化过程中IFN-γ的分泌能力也明显减低；④MSCs下调T细胞对克隆形成细胞的抑制效应的作用消失。从而造成患者体内细胞毒性T细胞过度增殖，破坏再行干细胞，减少造血干细胞池，最终导致再障的发生。
2）骨髓MSCs在造血干细胞移植中的应用
研究表明，在放化疗及移植前的预处理中，骨髓微环境受到破坏，MSCs受损，减弱了其对造血的支持及调控作用[21-22]。骨髓MSCs与HSCs共移植可促进造血重建，并降低GVHD的发生率及程度，保留GVL效应。在多个报道[23-26]中提到，加入MSCs共移植，并没有出现输注相关毒性，即使应用半相合MSCs也是安全的，且没有感染增加的趋势；在这些报道中，同样发现MSCs可明显增强CD34+细胞重建造血的能力，增加HSCs植入率，缩短造血重建的时间，并减少GVHD的发生率，降低急慢性GVHD的严重程度。MSCs在应用时间点选择上与HSCs同时植入的抑制作用明显，延迟应用或GVHD发生后应用则抑制作用减弱。其输注剂量和频次尚需进一步探索。目前观点认为：①MSCs对aGVHD有治疗价值，可能通过免疫抑制和促进肝肠粘膜愈合发挥作用。②持久的免疫抑制还需要环孢素A加激素。③MSCs可反复应用且效果稳定。④HLA不合的MSCs也不诱发异源性免疫反应，1×106/kg就有足够的免疫抑制作用。
人骨髓MSCs的分离、培养及体外扩增技术已相对成熟，其临床应用的研究也越来越广泛，几乎涉及各个内外科疾病。随着人们对间充质干细胞认识的不断深入，MSCs在血液病中的应用也将越来越受到重视，目前在血液病领域，MSCs的研究已在白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及多发性骨髓瘤等多个疾病中开展。但目前骨髓MSCs尚存在许多亟需解决的问题，包括骨髓MSCs的特异性标志、MSCs生存的微环境中调控其增殖和分化的关键作用因子、以及MSCs应用于临床的最佳数量、时机以及安全性的评估等等,需要大家通过长期、大量的临床对照试验加以进一步探讨。