胎膜早破孕妇外周血脐血和胎膜组织中oxAATNE的表达

摘要：胎膜早破（premature rupture of the membranes,PROM）即临产前发生胎膜破裂。其发生率，国外报道为5%～15%，国内为2.7%～7%。未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the membranes pPROM）是指妊娠20周以后、未满37周，在临产前发生的胎膜破裂。发生率为20%～3.5%。PROM是产科常见的妊娠期并发症，且近年发病呈上升趋势。关于PROM的发病原因，主要包括生殖道感染、羊膜腔压力增高、营养因素及其它，如：细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α升高，激活溶酶体酶，破坏羊膜组织导致胎膜早破；此外，羊膜穿刺不当、人工剥膜、妊娠晚期性生活频繁等均有可能导致胎膜早破。目前国内外研究较多的是PROM与感染的关系[1]。
　　　PROM与感染互为因果，PROM合并感染后可表现为临床绒毛膜羊膜炎和组织学绒毛膜羊膜炎（HCA），临床绒毛膜羊膜炎患者和胎儿可有临床表现，而HCA患者多表现为亚临床感染。PROM合并HCA可导致孕妇发生胎盘早剥、产后出血、产褥感染、败血症等围产期并发症；新生儿发生感染性疾病如：新生儿肺炎、脑白质损伤的机率增加。因此提早预测HCA的发生具有重要意义。
　　　氧化型α1-抗胰蛋白酶（ox-AAT）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）即与PROM的发生有关又在炎症瀑布反应中起调节作用。因此，本研究通过检测PROM患者外周血、新生儿脐血及胎膜组织中ox-AAT和NE的表达变化，探讨其与PROM合并HCA的关系，期望寻找预测PROM合并HCA的实验室指标。
目 的
本研究通过检测比较PROM孕妇血清、新生儿脐血血清及孕妇胎膜组织中ox-AAT和NE的水平有无差异，探讨PROM孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT和NE的表达变化与HCA的关系。
　　资料与方法
1 研究对象：
　　　选择2012年9月至2013年3月在郑州大学第三附属医院住院分娩的PROM孕妇60例，年龄为18岁～40岁，孕周为30+6周～40+2周。PROM的诊断参照谢幸、苟文丽主编的《妇产科学》第8版[1]。排除有临床感染症状（孕妇T>37.8℃、P>120次/分、胎儿HR>160次/分，伴下列两条标准中的任意一条：子宫压痛或羊水有臭味）、肝炎、肾炎、上呼吸道感染等感染性疾病的PROM孕妇。根据产后胎盘组织的病理结果（每高倍镜下炎性细胞数量>5个）[2,3]分为HCA组（PROM合并HCA）及对照组（未合并HCA）。新生儿感染性疾病的诊断以新生儿科诊断为准。
2 实验方法：
2.1 血清标本采集：入选孕妇，入院后未应用抗生素前，留取外周血5ml，3500r/min离心10min，取上清液-80℃保存。胎儿娩出后，胎盘娩出前留取脐血5ml，处理同孕妇外周血。
2.2 胎盘组织标本采集：胎盘娩出后取胎膜破口至胎盘边缘的胎膜，冷生理盐水冲洗表面血迹，使成卷状，用大头针固定，放入冻存管，迅速投入液氮。同时避开钙化点取2cm×2cm大小胎盘全层3块～4块，用甲醛固定，行病理检查，根据病理检查结果分组。
2.3 采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)法检测孕妇外周血、新生儿脐血中ox-AAT和NE的水平。
2.4 采用逆转录PCR技术检测胎膜组织中ox-AAT mRNA、NE mRNA的表达水平。
3 统计学方法：
　　　应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用x±S表示；组间比较采用独立样本的t检验或秩和检验;计数资料采用率表示,组间比较用2检验;相关性分析采用Pearson相关分析。所有检验水准为“α=0.05”。
结 果
1 HCA组和对照组孕妇一般临床资料的比较：
　　　两组孕妇的年龄、产次、分娩孕周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；HCA组孕妇破膜-胎儿娩出时间、WBC计数及CRP水平较对照组高，但差异均无统计学意义（P>0.05）。
2 60例PROM孕妇HCA的发生情况
60例PROM患者中HCA组22例，对照组38例；HCA的发生率为：36.7%。 3 两组孕妇外周血和新生儿脐血中ox-AAT及NE的表达水平
　　　HCA组孕妇血清中ox-AAT（2.328±0.014）ng/L和NE（0.407±0.082）ng/L水平均高于对照组（1.503±0.12、0.260±0.090）ng/L（P<0.05）;HCA组新生儿脐血中ox-AAT（2.920±0.182）ng/L和NE（0.744±0.065）ng/L水平均高于对照组（2.433±0.004、0.415±0.010）ng/L （P<0.05）。4 两组胎膜组织中ox-AAT mRNA及NE mRNA的水平　　　HCA组胎膜组织中ox-AAT mRNA(0.960±0.03)和NE mRNA(0.670±0.075）水平均高于对照组(0.532±0.01、0.271±0.09）（P<0.05）。5 相关性分析5.1 HCA组孕妇外周血中ox-AAT的水平与脐血中ox-AAT的水平具有正相关性，r=0.825，P<0.05;HCA组孕妇外周血中NE的水平与脐血中NE的水平呈正相关r=0.847，P<0.05。5.2 HCA组孕妇外周血中ox-AAT与NE具有正相关性，r=0.885，P<0.05；新生儿脐血中ox-AAT与NE具有正相关性，r=0.756，P<0.05；胎膜组织中ox-AAT和NE具有正相关性，r=0.876，P<0.05。6 两组产妇及新生儿结局的比较 60例孕妇中无一例合并胎盘早剥、产后出血及产褥感染。HCA组以剖宫产终止妊娠者18例，对照组9例，组间比较，差异有统计学意义（2=12.59，P<0.05）。60例新生儿，HCA组中1例因败血症死亡，无新生儿脐炎及坏死性肠炎发生，15例发生肺炎，对照组中13例发生肺炎，组间比较差异有统计学意义（2=6.461，P<0.05）。结 论1 孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT、NE水平升高与PROM合并HCA密切相关。2 ox-AAT和NE有望成为预测PROM合并HCA的指标。　　　关键词：组织学绒毛膜羊膜炎 氧化型α1-抗胰蛋白酶 中性粒细胞弹性蛋白酶 新生儿 3 细胞因子与妊娠期高血压疾病的相关性 妊娠期高血压疾病（hpertensive disorders complicating pregnancy，HDCP）是妊娠与血压升高并存的一组疾病，基本病理生理变化是全身小血管痉挛，内皮损伤及局部缺血，主要临床表现为高血压，较重时出现蛋白尿，严重时发生抽搐。在胎盘娩出后常很快缓解或可自愈，有学者称之为“胎盘病”。发生率约5%～12%。严重影响母婴健康，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因。关于妊娠期高血压疾病的病因，至今不明，很多学者认为是母体、胎盘、胎儿等众多因素作用的结果。主要病因学说包括：1.子宫螺旋小动脉重铸不足：正常妊娠时，子宫螺旋小动脉管壁平滑肌细胞、内皮细胞凋亡，代之以绒毛外滋养细胞，且深达子宫壁的浅肌层。充分的螺旋小动脉重铸是血管管径扩大，形成子宫胎盘低阻力循环，以满足胎儿生长发育的需要，但研究发现妊娠高血压患者的滋养细胞浸润过浅，只有蜕膜层血管重铸，即“胎盘浅着床”，螺旋小动脉重铸不足是胎盘血流量减少，引发子痫前期的一系列表现。2.血管内皮细胞受损：血管内皮细胞损伤时子痫前期的基本病理变化，可使扩血管物质如：一氧化氮（NO）、前列环素I2合成减少，而缩血管物质如内皮素（ET）、血栓素A2等合成增加，从而促进血管痉挛。此外血管内皮损伤还可激活血小板及凝血因子，加重子痫前期高凝状态。3.遗传因素:妊娠期高血压疾病具有家族倾向性，提示，遗传因素与该病发生有关，但遗传方式尚不明确。由于子痫前期的异质性，尤其是其他遗传学和环境因素的相互作用产生了复杂的表型。影响子痫前期基因型和表型的其它因素包括：基因多态性、基因种族特点、基因相互作用及环境，特别是基因和环境相互作用是极重要的。4.营养缺乏：有调查发现不发达地区子痫前期的发病率较高，推测营养因素如钙、镁、锌、硒及维生素C、E等的不足与子痫前期的发生发展有关。早在1980年，Belizan等研究发现低钙血症与妊娠期高血压病有关。血清中钙离子浓度降低可通过促进甲状旁腺激素或肾素释放导致血压升高、血管平滑肌细胞收缩。钙还可以间接使血清中镁离子浓度升高，降低子宫胎盘血流阻力。妊娠中晚期，补充钙离子直接降血压作用要比通过保护内皮细胞的损伤更能阻止子痫前期的发展。抗氧化剂是保护细胞不受氧化应激的核心物质，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和硫氧还蛋白还原酶(ThxRed)为硒依赖酶，这两个酶的活化需要体内有足够的硒元素，有研究证明补充硒元素可以上调以上两种酶的活性，从而保护组织不受氧化损伤，对可能发生子痫前期的孕妇有保护作用。此外，许多研究已经证实胎盘的氧化应激是子痫前期发的关键中间步骤，氧化应激损伤指标在子痫前期患者中浓度升高，而抗氧化物质如维生素C、E在血清以及组织中浓度降低。抗氧化剂在正常妊娠、维持细胞功能方面发挥重要作用，通过保护酶和蛋白的功能维持细胞的完整性，维生素C可以清除水相氧自由基，维生素E在体外可以阻止脂质的过氧化反应，从而保护氧化应激导致的细胞或细胞内结构受损，有研究认为血清中维生素E和维生素C浓度降低，可通过降低抗氧化功能，加重内皮细胞的损伤，在子痫前期的发生、发展过程中其重要作用，但也有研究证明补充维生素C和维生素E不能保护孕妇不患子痫前期。锌是新陈代谢、生长、发育、生殖的重要微量元素，在维持细胞膜的结构和功能方面起重要作用，是许多酶的组成成分，妊娠以后，锌在孕妇血清中的结合能力下降，以利于能通过胎盘传输给胎儿，有研究证明血清中锌缺乏与子痫前期有关。5.胰岛素抵抗(IR)：IR主要表现为高胰岛血症、脂代谢紊乱，研究发现IR患者体内一氧化氮（NO）含量降低，前列腺素E2合成减少，推测其通过增加外周血管阻力在妊娠期高血压疾病的发生、发展中起重要作用。6.炎症免疫过度激活：胎儿是一个半移植物，成功的妊娠要求母体免疫系统对其充分耐受，子痫前期患者无论是母胎界面局部还是全身均存在着炎症免疫反应过度激活的现象。也有证据显示，母胎界面局部处于主导地位的天然免疫系统在子痫前期发病中起重要作用。Toll样受体家族、蜕膜自然杀伤细胞（dNK）、巨噬细胞等的数量、表型和功能异常均可影响子宫螺旋小动脉重铸，造成胎盘浅着床。特异性免疫研究集中在T细胞，正常妊娠时母体Th1/Th2免疫状态想Th2漂移，但子痫前期患者蜕膜局部T淋巴细胞向Th1漂移。近年发现，CD4+、CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg细胞）参与Th1/Th2免疫状况的调控。当Treg细胞显著减少时，促进Th1占优势，使母体对胚胎免疫耐受降低，引发子痫前期。此外，炎性介质如TNF-α、IL-6、极低密度脂蛋白等可引起子痫前期血管内皮损伤，也包括氧化应激反应。 有学者[53]认为：妊娠过程中，HLA-G在胎盘绒毛外滋养细胞表达的高度选择性是导致胎盘的血管重铸及母胎之间免疫耐受的关键因子。且用实验证明HLA-G8外显子14bp缺失多态性可能导致母胎界面的免疫调节失衡，促进妊娠期高血压疾病的发生、发展。 近年来，炎症刺激成为妊娠期高血压病的研究热点，寻找可以预测子痫前期的细胞因子是临床工作者关注的问题。李亚敏[54]等研究证明，P-选择素（P-selectin）与晚期糖基化终产物受体（recepor of asvanced glycation end products RAGE）在子痫前期的发生、发展中起作用。妊娠期高血压患者胎盘组织中RAGE表达异常升高时，可通过MAPK、P21Ras基因、NF-kB及Janus JAK/STAT信号转导途径，刺激炎症靶基因的表达，诱导细胞因子的活化和分泌，促进系统性炎症反应和血管内皮的损伤,是血管内皮损伤的重要炎性因子。当胎盘缺血缺氧时，局部代谢物刺激血小板活化、血管内皮细胞损伤,P-Selectin表达增强，使TNF-α分泌增加，导致IL-6、IL-1、IL-8及MCP-1等炎症因子表达，同时，P-selecti可增加白细胞与血管内皮细胞之间的黏附反应，增强血管内皮的炎症反应。在子痫前期的发生发展中起主要作用。NF-kB是许多炎性因子的转录激活子，通过在转录水平调节目的基因水平发挥激活功能，如可调节编码TNF-α、IL-6、IL-1β、趋化因子及粘附分子，参与机体的感染、炎症反应等生理病理过程。研究[55]发现NF-kB在子痫前期孕妇静脉血中的表达高于正常孕妇，其目的基因：TNF-α、IL-6、P-selectin等也表达升高，分析可能与NF-kB的激活参与了胎盘血管炎症反应有关，从而导致小血管壁重构，发生子痫前期。 Krajewski P等[79]采用ELISA检测合并IUGR及符合孕周体重的新生儿外周血中IL-6、IL-8及IL-18的浓度，结果发现诊断为IUGR的新生儿外周血中IL-6及IL-18的浓度显著升高，推测炎症参与IUGR的发生。Smerieri A等[80]研究发现胎盘组织中IL-6浓度在IUGR孕妇明显升高，推测IL-6这一炎症因子在IUGR发生过程中起调控作用。5 细胞因子与妊娠期合并肝内胆汁淤积症的相关性　　妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnacy,ICP）是妊娠期特有的并发症，发病率0.1%～15.6%不等，有明显的地域和种族差异，我国长江流域等地发病率较高。以妊娠中、晚期出现皮肤瘙痒和黄疸为主要临床表现，主要危害胎儿，使围产儿病死率增高，血清胆汁酸升高是最主要的特异性实验证据。关于ICP的病因，目前尚不清楚，可能与雌激素、遗传及环境等因素有关。临床发现ICP多发生在高雌激素水平状态，雌激素可使NA+、 K+-ATP酶活性下降，能量提供减少，导致胆汁酸代谢障碍；雌激素可使肝细胞膜中胆固醇与磷脂比例上升，胆汁流出受阻，诱发ICP。此外，ICP的发病与季节有关，冬季高于夏季；妊娠妇女血硒水平降低，导致谷胱甘肽过氧化酶活性降低，增加患ICP的机率。　　　既往对ICP的研究多是临床观察分析，近年来，对ICP的研究已深入到分子水平。免疫因素是研究的热点。Th1与Th2细胞因子的平衡是维持正常妊娠的重要表现，Th1与Th2的失衡是许多疾病发生的原因所在。正常妊娠时Th2起主导作用，维持母胎界面的免疫平衡。许多研究发现，ICP患者Th2优势向Th1方向偏移，导致母胎间免疫反应增强，使免疫耐受受到抑制。有学者[81]对ICP患者的胎盘进行组织学形态观察发现：ICP患者胎盘的绒毛合体结界增多，绒毛间质水肿伴空泡形成、绒毛间腔狭窄、滋养层细胞肿胀及绒毛纤维素样坏死。　　　此外，细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling3,SOCS3）是由细胞因子受到诱导后产生，对信号通路有负反馈调节的蛋白分子，而且，可以调节Th1/Th2细胞因子向Th2偏移[82]。有研究认为，SOCS3的缺乏与妊娠失败及妊娠并发症的发生有关，可使母胎界面的免疫状态受到影响[83]。有研究证明[84]，IFN-、TNF-α在ICP患者外周血中的水平显著高于正常妊娠妇女，IL-4水平显著下降。这些都提示ICP患者存在Th2向Th1偏移，细胞因子在ICP的发生中起重要作用。国内张丽娟等[85]实验证明以上结果，并且发现：SOCS3在ICP孕妇胎盘组织中的表达较正常孕妇低，与病情的轻重呈负相关。推测SOCS3参与ICP的发病，SOCS3水平降低，对IFN-及IL-10的抑制作用减弱，导致IFN-高表达、IL-10表达减少，使Th2向Th1漂移，促进ICP的发生。　　　[1] 谢幸,苟文丽.妇产科学.8版.北京:人民卫生出版社,2013:94-95. [2] Michael S.Kramer,Cynthia Berg,Haim Abenhaim.et al.Incidence,risk factors,ad temporal trends in severe postpartum hemorrhage.Am J Obstet Gynecol,2013,209:449.e1-7.[3] Ariel A.Salas,MSPH,Ona M.Faye-Petersen,Brian Sims.et al.Histological Characteristics of the Feetal Inflammatory Response Associated with Neurodevelopmental Impairment and Death in Extremely Preterm fants.The Journal of Pediatrics,2013,163(3):652-657.[4] Howman RA,Charles AK,Jacques A.et al.Inflammatory and haematological markers in the maternal,umbilical cord and infant circulation in histologica chorioamnionitis. PLoS One,2012,7(12):e51836.