戊乙奎醚对内毒素致新生大鼠肠损伤时缺氧诱导因子1α及谷氨酰

摘 要
新生儿肠损伤是儿科常见的疾病之一，其发生的主要原因有早产、窒息引起的缺血缺氧以及感染等。其中严重感染常可导致危重患儿胃肠功能衰竭。肠道在全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展过程中扮演着极其重要的角色。肠道感染或缺血缺氧会导致肠粘膜屏障功能受损，引起细菌及内毒素的移位，引发败血症和脓毒性休克，从而进一步加重肠组织的损伤，甚者可伴随远隔器官受累。LPS作为典型的内毒素, 可诱发内毒素血症，导致肠黏膜损害。国内外诸多研究发现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和谷氨酰胺（Gln）在内毒素性肠损伤的病理改变过程中具有重要作用。盐酸戊乙奎醚（PHC）是我国自主研制的抗胆碱药。研究表明，盐酸戊乙奎醚因能改善微循环、降低毛细血管壁通透性和减少溶酶体释放而具有多器官保护作用。目前盐酸戊乙奎醚对内毒素性肺损伤的保护作用得到了广泛地证实和认可，我们通过大量的临床观察发现盐酸戊乙奎醚在解除肠痉挛、减轻肠道水肿方面同样具有良好的效果。基于以上背景，本课题旨在研究内毒素致新生大鼠肠损伤时盐酸戊乙奎醚预先给药对肠组织HIF-1α和Gln表达的影响，以及对其肠保护作用机制进行初步探讨。
目 的
探讨盐酸戊乙奎醚预先给药对内毒素致新生大鼠肠损伤时HIF-1α和Gln表达的影响及其肠保护作用相关机制，为临床防治新生儿肠损伤提供一条新的思路。
材料与方法
1. 研究对象
60只SPF级健康新生7日龄SD大鼠，由郑州大学河南省实验动物中心提供，雌雄不限，体重18±2g。
2. 实验方法
2.1 实验动物分组
本实验分为两部分。第一部分：将30只幼鼠随机分为3组，每组10只。分别为对照组（C组）、肠损伤模型组（L组）和盐酸戊乙奎醚干预组（P组），用以测定肠组织湿/干重比、观察肠组织形态学的改变和检测肠组织中细胞因子的表达。第二部分：30只幼鼠同样随机分为3组，C组4只，L组和P组各13只，用以观察造模后幼鼠行为学的变化并计算每组24h生存率。
2.2 动物模型的制备
肠损伤模型组腹腔注射内毒素（细菌脂多糖LPS，E.Coli 055：B5，Sigma公司，美国）5mg/kg，配制浓度为0.5mg/ml；盐酸戊乙奎醚干预组在注射内毒素前30min，先腹腔注射盐酸戊乙奎醚（成都力思特制药股份有限公司，批号：120603）2mg/kg，配制浓度为0.05mg/ml；对照组腹腔注射生理盐水10ml/kg。第一部分实验于腹腔注射内毒素或生理盐水后6h麻醉并解剖幼鼠。两部分实验均在造模完成后将幼鼠放回鼠笼与母鼠共同喂养。
2.3 肠组织的标本采集
在密闭玻璃容器中吸入七氟烷快速麻醉幼鼠后，将其固定于操作台，解剖，用1ml注射器迅速心脏采血，静置2小时，4℃下4000r/min离心15分钟，取上清液，-20℃冰箱中保存待检。距回盲部3cm向上取回肠组织7cm，4℃生理盐水冲洗肠管3遍，滤纸吸干肠组织表面水分后，将7cm回肠组织分为4段。上段1cm用于光镜下形态学观察，中上段2cm用于测量肠组织湿重和干重，中下段2cm用于制备肠组织匀浆，下段2cm用于RT-PCR检测肠组织HIF-1α mRNA的表达。
2.4 检测指标
2.4.1 计算肠组织湿/干重比（W/D）
电子称重计称量中上段2cm回肠组织并记录湿重，随后放入70℃恒温烘干箱烘干48h至重量不再发生变化，测量干重，计算湿/干重比。
2.4.2 肠组织形态学观察
将上段1cm回肠组织放入4%多聚甲醛中保存待检。石蜡包埋后制作4μm病理切片，行HE染色。400倍光镜下观察回肠组织粘膜上皮细胞形态学的改变。
2.4.3 ELISA法测定肠组织中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln、二胺氧化酶（DAO）及血清DAO的含量
中下段2cm回肠组织称重后制备组织匀浆，4℃下3000r/min离心15分钟，取上清液，置于-20℃冰箱保存待检。TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln和DAO的检测严格按照ELISA试剂盒（R&D公司，美国）说明书进行。
2.4.4 RT-PCR法测定肠组织HIF-1α mRNA的表达
将下段2cm回肠组织经DEPC水冲净后滤纸吸干，迅速经液氮冷却后放入冻存管中，置于-80℃冰箱保存待检。经肠组织总RNA的提取、逆转录、DNA扩增和琼脂糖凝胶电泳等步骤检测幼鼠肠组织HIF-1α mRNA的表达情况。
3．统计学处理
采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差( ± s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差异法（LSD-t），以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。结 果1.肉眼观察，腹腔注射LPS后，1小时内L组与P组幼鼠开始出现浑身抖动，呼吸急促。2~3小时左右出现周身发凉，精神萎靡，活动度下降，并且进食减少。6小时左右出现明显的倦怠乏力，几乎不活动也不进食，甚者口唇青紫。P组幼鼠症状相对较轻，C组幼鼠活动、进食等情况正常。C组、L组及P组的24h生存率分别为100%、69.2%和92.3%，幼鼠死亡主要发生在注射LPS后12~24小时期间。2.与C组比较，L组和P组肠组织湿/干重比均显著升高（P<0.05）；与L组比较，P组的这一比值显著降低（P<0.05）。差异均有统计学意义。3.HE染色光镜结果显示：C组回肠绒毛结构完整，上皮细胞排列整齐，形态正常；L组可见绒毛细胞水肿，炎性渗出，上皮细胞排列紊乱；P组绒毛水肿、炎性渗出较L组均明显减轻，上皮细胞排列较整齐。4.与C组比较，L组和P组肠组织TNF-α、IL-6、HIF-1α的含量均升高（P<0.05），而Gln的含量降低（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织Gln的含量较高（P<0.05），而余各指标的含量均较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。5.与C组比较，L组和P组肠组织DAO含量均显著降低，而血清DAO含量升高（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织DAO含量较高，而血清DAO含量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。6.与C组比较，L组和P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量均升高（P<0.05）；与L组相比，P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。结 论 盐酸戊乙奎醚预先给药后幼鼠肠组织水肿明显减轻，炎症因子表达显著降低。其作用机制可能是盐酸戊乙奎醚通过下调HIF-1α的表达及维持Gln的含量，减轻肠道炎症反应，保护肠粘膜屏障功能，从而起到肠保护作用。关键词：盐酸戊乙奎醚；内毒素；肠损伤；缺氧诱导因子-1α；谷氨酰胺，二胺氧化酶4.2.1 抗炎抗氧化炎症反应是内毒素性肠损伤时的重要特征。炎症因子的瀑布级联式反应导致肠组织及循环中炎症因子的失控表达会加重器官损伤。孙梅的团队做了关于肠三叶因子（ITF）方面的研究。她们发现基因重组ITF能够下调iNOSmRNA的表达，减少NO的生成和MDA的含量，从而降低了内毒素导致的幼鼠肠组织炎症反应，对肠粘膜起了一定的保护作用[66]。另一项研究发现ITF可能通过抑制TLR4与LPS的结合从而阻止了LPS介导的细胞内信号传导，进而影响到NF-κB的入核和启动下游基因的转录，因而抑制了炎症介质的合成和释放，减轻肠粘膜损害[67]。同样地，该团队在一项研究中发现超氧化物歧化酶（SOD）在各个时相点中，LPS组的表达均低于对照组，说明了氧化损伤在LPS介导的组织损伤中起了重要作用。应用血小板活性因子受体拮抗剂银杏苦内酯B能够将SOD维持在较高水平，从而更多地清除氧自由基，减轻了LPS介导的氧化损伤[68]。另外一项近期的研究发现重要成分黄连素能预处理能够通过提高SOD和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低丙二醛（MDA）和NO的水平，从而减轻LPS介导的氧化损伤。同时也能够通过下调回肠TLR4和NF-κB的表达，抑制下游炎症介质的过度产生而减轻肠组织炎症反应[69]。国外的一项研究发现10mg/kg和50mg/kg的大蒜油预处理能够降低LPS刺激下血清sl-选择素、sICAM-1、中性粒细胞内CD11b、肠ICAM-1的表达和肠组织中性粒细胞的浸润，从而起到抗炎作用[70]。4.2.2 降低肠粘膜通透性肠粘膜通透性的降低为内毒素进入循环提供了有利条件，炎症、氧化应激状态都会增加肠粘膜通透性。因此如何在肠屏障功能受损的情况下降低肠粘膜通透性，维持肠粘膜屏障的完整性则尤为重要。其中紧密连接发挥着重要作用。对于Gln的大量研究证实，静脉或口服Gln能够增加肠上皮细胞间阻力，降低肠粘膜通透性，增强肠屏障功能，提高患者预后[71-73]。有研究报道乳铁蛋白能够增加跨上皮细胞电阻，维持紧密连接的功能，从而减轻LPS诱导的肠粘膜屏障损害[74]。同样地，在一个内毒素血症大鼠模型中，中药成分黄连素能够下调肌球蛋白轻链激酶通路，改善肠粘膜紧密连接的损伤，降低了肠粘膜通透性[75]，这一机制也在另一项关于卡巴胆碱的研究中得到证实[76]。4.2.3 抗肠上皮细胞凋亡重度内毒素血症时会引起肠上皮细胞的大量凋亡，这是内毒素性肠损伤的机制之一。因此抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，将有助于保护肠粘膜屏障功能的完整性。国内的一些研究发现内毒素血症时肠上皮细胞凋亡增加伴随Caspase-3的激活，而增生细胞核抗原（PCNA）表达下降[77-78]，说明此时肠上皮细胞的凋亡明显多于增殖。这也证实了细胞凋亡在内毒素性肠损伤中的重要作用。这一观点也被国外的一项研究支持[79]，该研究发现TNFR1在LPS诱导的肠上皮细胞凋亡中起重要作用，这一通路依赖NF-κB2的调节。在抗凋亡的研究中，Sukhotnik等人[80]发现Gln能够刺激肠上皮细胞的不断增殖和移行而抑制凋亡。国内近期的一项研究发现黄连素同样能够通过非α2-肾上腺素受体依赖途径抑制肠上皮细胞凋亡[81]。也有研究报道双歧杆菌能够通过COX-2依赖的途径抑制坏死性小肠结肠炎中肠上皮细胞的凋亡[82]。同样地，Rho激酶抑制剂Y-27632能够抑制新生大鼠内毒素血症时肠上皮细胞的凋亡而保护肠粘膜屏障功能[83]。4.2.4 内毒素耐受内毒素耐受指的是预先用小剂量或亚致死剂量LPS刺激机体后，机体对随后的大剂量或致死剂量的LPS呈低反应性的甚至无反应的现象[84]。目前对于内毒素耐受在肠保护方面的研究较少，其具体机制有待进一步研究解决。比较明了的是LPS预处理后产生的内毒素耐受性使得单核细胞和巨噬细胞对于促炎介质如TNF-α和IL-1β的产生明显降低[85]。国内的一项研究在不同时间点用不同小剂量的LPS腹腔注射预处理大鼠后，肠粘膜ICAM-1表达减少，而sIgA表达增加，这对减轻中性粒细胞黏附和聚集从而减轻炎症因子的释放和增强肠免疫屏障的功能大有益处[85]。然而不同的是，Stilla Frede等人[86]用240gLPS预处理10~20周的C57BL/6小鼠，发现内毒素耐受抑制了HIF-1α的表达，其下游磷酸激酶1和肾上腺髓质素的表达水平也随之减少，并且耐受的细胞在低氧条件下的存活能力也显著降低，从而得出结论内毒素耐受降低了单核细胞在缺氧条件下的生存能力和功能。造成这一矛盾的原因可能二者对于内毒素暴露的时间不同，导致内毒素预刺激所起到的作用也不同。因此，后续还需大量的研究来明确内毒素耐受的信号传导机制和合适的剂量以确保收到明确的器官保护作用。5.总结本文对内毒素的结构、功能和在体内的转运、转归以及肠组织生理功能等方面做了概括性回顾。对败血症动物模型做了较为详细地介绍。最后对国内外一些针对内毒素血症时肠保护方面的研究在机制上做以分类总结。肠道对于人体的重要性已经不需赘述，虽然近几十年来针对内毒素性肠损伤不断有新的治疗措施出现，但其发病率和死亡率在重症患者中仍然很高。目前没有哪一种单一的药物和治疗措施能够在临床败血症的常规治疗中有效抑制炎症因子的异常释放。我们现在所得到的大量的数据都来自于动物试验，即便有些治疗措施在动物模型上有效，其仍然不能通过临床试验，更不能应用于临床。人体是一个复杂的有机体，任何病理情况的出现都会引起大量的细胞反应和分子间的相互作用。对于疾病的认识，并不是某一方面就能够解释清楚的。因此，为了更好地阐明内毒素性肠损伤的病理过程和发掘更有效的干预措施，仍需要大量科研工作者不懈的努力。参考文献[1] Elin, R.J., S.M.Wolff. Biology of endotoxin[J]. Annu. Rev. Med,1976, 27:127–141.[2] Raetz,C.R.,C.Whitfield.Lipopolysaccharideendotoxins[J].Annu.Rev.Biochem,2002,71:635–700.[3] Erridge, C., E. Bennett-Guerrero, I.R. Poxton. Structure and function of lipopolysaccharides [J]. Microbes Infect, 2002, 4:837–851.[4] Buttenschoen, K., P. Radermacher, H. Bracht. Endotoxin elimination in sepsis: Physiology and therapeutic application[J]. Langenbecks Arch. Surg., 2010, 395:597–605.