不同浓度雌二醇及PGE2对人子宫内膜基质细胞增殖及PCNA表

宫腔粘连(intrauterine adhesions，IUA)是由于各种原因导致子宫内膜基底部全部或部分缺损、变薄，导致子宫前后壁粘连、宫腔闭锁导致宫腔容积减小，引起患者月经改变和生育异常。近年来随着人流、药流手术及宫腔操作的增多，宫腔粘连已成为妇科常见病之一，并且成为不孕、流产、早产的一项重要原因。宫腔粘连治愈率低下，手术分离后粘连易发，严重影响着广大女性的身体及心理健康。因此宫腔粘连分离术后如何防止粘连复发、促进内膜生长的治疗是临床工作的一大难题。目前宫腔粘连分离术后多采用人工周期治疗2～3个月促进子宫内膜的再生，防止粘连复发。但雌激素剂量及疗程目前尚无明确规定，主要是根据患者的粘连程度、类型以及术者的经验，且治疗效果并不太满意，子宫内膜的发育并不能得到很好的改善。有些学者认为对雌激素生理剂量无效的子宫内膜，可加大雌激素剂量促进子宫内膜的生长。但也有研究发现子宫内膜基底层严重受损后，内膜再生能力下降，高雌激素水平可能导致某些纤维化细胞因子水平的上升，反而促进宫腔粘连的形成。雌激素的不同用量以及应用时间的长短对子宫内膜生长作用的影响尚不明确。
　　　感染对宫腔粘连的发病仍存在争议，目前尚无研究证明感染可直接诱导宫腔粘连的发生，但学者们对感染可促进宫腔粘连的进一步发展已基本达成共识。有学者发现有些宫腔粘连患者同时存在输卵管周围粘连、子宫内膜亚急性或慢性炎症及细菌感染，说明炎症反应在宫腔粘连的发生中起着重要作用。感染后的炎症反应可能导致子宫内膜损伤加剧，引起子宫内膜修复障碍，加速宫腔粘连的再形成。在所有的致炎因子中，前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)是一种重要的细胞生长和调节因子，对多种细胞的增殖及生物学功能有调节作用，并与子宫内膜生理及病理密切相关。它能诱导全身炎症反应，增强细胞中胶原生物的合成，促进炎性区域发生纤维化改变。但它在能否促进宫腔炎症的发生从而加剧宫腔粘连形成方面的研究尚少。
目的
　　　本课题通过子宫内膜基质细胞体外培养传代系统，应用不同剂量、不同时间雌二醇及炎症介质前列腺素E2作用于细胞，采用MTT法及Real time PCR法观察雌二醇及炎症因子PGE2对子宫内膜基质细胞生长的情况，为进一步探索宫腔粘连分离术后辅助雌激素治疗的剂量、时间以及炎症对内膜增长有无影响、如何修复缺损子宫内膜的生长、改善宫腔环境、提高妊娠率提供部分实验依据。
方法
　　　1.采用胶原酶消化法及筛网法分离培养人子宫内膜基质细胞，MTT法绘制细胞正常生长曲线，观察细胞生长周期。通过形态学及免疫组化法对培养的细胞进行鉴定。
2.将人子宫内膜基质细胞分为对照组：加入正常培养液。雌二醇组：分别加入浓度为1×10-9、10-8、10-7、10-6mol/L雌二醇。雌二醇+PGE2组：同时分别加入不同浓度的雌二醇和PGE2（浓度为50ng/L),PGE2组只加入PGE2（浓度为50ng/L)。MTT法间接测定各组别子宫内膜基质细胞增殖情况，实时荧光定量PCR法测定各组细胞内PCNA mRNA表达的变化。
　　3. 将所有实验数据以均数±标准差(±S)表示，独立样本间采用t检验分析，各组间资料采用单因素方差分析法分析，采用LSD-t检验法进行两两比较，检验水准α=0.05。
　　
结果
1.细胞形态学特点及免疫组化结果：培养出的基质细胞多为多角形，细胞两端有多个短小突起，细胞排列无极性，贴壁生长。随着细胞的传代培养，细胞逐渐拉长成梭形，具有成纤维细胞形态。
　　2.细胞生长周期一般为7-10天，第1天为潜伏生长期，第2-4天进入对数生长期，5-6天后达平台期，7天后逐渐萎缩消退。基质细胞特异的波形蛋白抗体(Vimentin)染色阳性，阳性细胞胞质呈棕黄色，角蛋白抗体染色阴性。
　　3.随着作用时间的延长，雌二醇组基质细胞增殖率明显升高，细胞增殖呈时间依赖性，差别有统计学意义（P<0.05），而各组浓度之间并无明显差异(P>0.05）。24h雌二醇+PGE2组与E2组比较，细胞平均增殖率升高，差异有统计学意义（P<0.05）。48h与72h雌二醇+PGE2组比较，细胞随着作用时间的延长虽有增长趋势，但与雌二醇组相比，细胞生长速率明显下降。　　4.24h雌二醇组细胞PCNA mRNA的相对表达量高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。随着作用时间的延长，72h雌二醇组细胞PCNA mRNA的相对表达量明显升高，与48h、24h相比，差别均有统计学意义（P<0.05），而各组浓度之间无明显差异(P>0.05）。24h雌二醇+PGE2组与雌二醇组比较，PCNA mRNA的相对表达量升高（P<0.05）。48h与72h雌二醇+PGE2组比较，细胞PCNA mRNA的相对表达量随着作用时间的延长虽有增长趋势，但与雌二醇组相比，明显下降（P<0.05）。　　结论 　　　1.体外成功分离培养人子宫内膜基质细胞，细胞形态学及波形蛋白染色阳性均符合子宫内膜基质细胞特征。　　　2.雌二醇可促进子宫内膜基质细胞的增殖，但增殖作用非浓度依赖性而是时间依赖性。　　　3.炎症介质前列腺素E2早期可使子宫内膜细胞反应性增生，随着时间的延长，明显降低子宫内膜细胞的生长速率，其可能参与宫腔炎症的发生，加速宫腔纤维化的形成。　　　 关键词 宫腔粘连 子宫内膜 基质细胞 雌二醇 前列腺素E2 增殖细胞核抗原7.3.4 其他 目前已有报道将阿司匹林、硝酸甘油、枸橼酸西地那非等血管扩张剂用于IUA患者以提高子宫肌层的血流供应，改善妊娠结局。Zinger M等[53]学者曾于2006年报道了2例TCRA术后患者因子宫内膜薄经阴道使用枸橼酸西地那非成功妊娠的案例。临床上一些子宫内膜发育不良的患者也可给予生长激素辅助治疗，促使子宫内膜间质疏松，丰富腺体和血管，增加子宫内膜血液供应，提高子宫内膜容受性，从而使子宫内膜发育更为成熟，提高妊娠率[54-55]。胡银逢等[56]学者将80例TCRA患者随机分为两组，一组术后放置IUD、球囊导管并辅以人工周期治疗，另一组术后5d皮下注射重组生长激素。其结果显示两组宫腔粘连复发率分别为45%和32.5%，表明生长激素能够促进术后子宫内膜修复再生。7.4 物理屏障 7.4.1 宫内节育器 TCRA术后放置宫内节育器(Intrauterine contraceptive device，IUD)辅以人工周期治疗是预防宫腔再粘连的传统方法。目前临床上多采用金属圆环预防IUA的复发，也有学者研究发现T型环对预防宫腔和宫颈管粘连的有效率达99.78%[57]。但IUD面积有限，不能完全分离子宫前后壁，对重度宫腔粘连疗效不足50%。严重的患者还可见IUD钳顿甚至包埋于粘连带内。刘明星等[58]研究发现，宫腔III度粘连以上的患者，TCRA术后宫腔单纯放置IUD组治愈率0%，有效率33.3%，置球囊加IUD组治愈率46.2%，有效率92.3%。宫腔放置IUD还可能出现阴道不规则出血、子宫穿孔、感染、嵌顿、异位等并发症，取环时的再次宫腔操作也可能对子宫内膜造成二次损伤。 7.4.2 FoIey球囊导管 　　　宫腔置入球囊导管可起到支架作用，有效分离子宫各侧壁，使子宫内膜沿着球囊表面增殖、修复，以达到效预防粘连复发的作用。它还可使子宫壁均匀受压，引流宫腔积血及炎性渗出物，有效减少术后出血及感染的发生。陈媛媛等[59]学者在93例宫腔粘连患者术后均放置球囊管，术后5天45例宫腔粘连患者宫腔再次放置新的Foley导管5天，48例宫腔放置节育器1个月(IUD)，术后均行人工周期及医用几丁糖防粘连。结果显示两组术后宫腔再粘连率分别为17.8％和41.7％，月经好转率分别为84.4％和60.4％。Orhue等[60]在59例患者TCRA术后宫腔放置Foley球囊导管lO天，81.4％月经恢复正常，妊娠率为33.9％，效果明显优于宫腔放置IUD。也有学者研究发现TCRA术后宫腔内放置球囊8天宫腔粘连复发率明显低于放置球囊5天，放置球囊8天与放置球囊ll天无明显差别，且球囊放置时间越长感染机会越大。一旦发现感染，必须立即取出导管，必要时使用抗生素治疗。7.6 羊膜移植 羊膜是附着在绒毛膜表面的一层半透明薄膜，由胎盘滋养细胞分化而来。羊膜基底膜可以调控细胞的分化、形态、运动及功能。在现代医学领域，羊膜主要用于减轻眼科睑球粘连及预防睑球粘连术后再次粘连的发生。羊膜代阴道成形术也广泛应用于妇科领域。羊膜移植可以有效隔离子宫内膜裸露的创面，使其周围正常内膜以其为支架进行移行生长，促进子宫内膜修复和生长，并通过抑制TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及TGF-βⅡ型受体在转录水平上的表达，使成纤维细胞生物学功能减低，减少纤维化及瘢痕组织的形成。羊膜是一种能够紧贴于创面的生物膜，其孔径一般为0.3-3.4微米，而细菌不易通过直径〈5微米的孔隙，可做为隔离细菌的一道屏障。Orhue等[65]学者认为，TCRA术后至少7d子宫前后壁分离的创面才能愈合，而羊膜在宫腔内可持续作用21d，弥补了普通生物胶制品作用时间不足的缺点。羊膜因其独特的优势，逐渐成为TCRA术后防粘连复发的一种新型技术手段。Amer等[66]于2006年报道了在12例中度及13例重度宫腔粘连患者TCRA术后应用Foley球囊行新鲜羊膜移植，并于2周后取出。其结果显示12例中度粘连患者粘连未再复发，月经量明显改善。13例重度粘连患者中复发率为48％，其中2例为中度粘连，10例为轻度粘连。2010年，Amer等[67]再次将45例宫腔重度粘连患者随机分为3组，3组患者于TCRA术后分别于宫腔放置球囊、新鲜羊膜移植及冻干羊膜移植，术后结果显示羊膜移植组患者宫腔粘连程度明显减轻，且新鲜羊膜移植效果好于冻干羊膜。但目前国内尚无TCRA术后行宫腔羊膜移植病例的报道，且国外学者的研究样本量小，缺乏大样本的临床随机对照研究，无法推断其远期可行性及有效性。对于子宫内膜基底层严重损伤且无正常内膜组织的患者，单纯的羊膜移植并不能使损伤的基底膜完全恢复。7.6 成体干细胞移植 干细胞具有自我更新、高度增殖潜力和多向分化的功能，在组织中调控细胞的增殖、分化和更新等。 Nagori等[68]于2011年报道了1例重度IUA的患者，通过自体干细胞移植修复子宫内膜，此后通过体外受精胚胎移植成功受孕的案例。Gargtt等[69]研究证实了成人干细胞在人类子宫内膜高度再生的功能属性，可以在体内重建子宫内膜组织。8 预防 术后患者的恢复情况与粘连的程度、性质、宫腔整体情况和个体素质等有关。近年来，随着人流术及宫腔操作的增加，宫腔粘连的发病率逐年升高，其引起的月经紊乱、不孕等严重影响着女性的生殖健康和生活质量。任何一种宫腔操作都有可能引起IUA。临床医生需严格掌握宫腔操作的适应症和禁忌症，严格执行无菌操作及操作规范，避免过度吸刮宫腔。育龄期妇女一定要注意避孕，并要加强孕期保健，尽量避免、减少人工流产术及引产术次数等，避免宫腔操作；避免生殖系统感染、注意生殖卫生。宫腔操作术后合理应用抗生素预防感染。人流术后口服短效避孕药或人工周期治疗可有效恢复月经周期及预防宫腔粘连的发生，但也有学者持相反态度。田秦杰等[70]学者发现GnRH-α可代替雌激素过敏者有效预防子宫纵隔电切术后宫腔粘连的发生。广大孕龄期妇女要提高保健意识，尽量减少宫腔操作，一旦出现月经量减少或闭经，应尽早检查。9 展望 目前，宫腔粘连主要集中在宫腔镜手术治疗后的疗效观察和术后如何预防再粘连的研究，对于宫腔粘连分离术的治疗效果和生殖预后与粘连的类型、范围及子宫内膜的损伤程度密切相判。重度粘连的病例，因其对子宫内膜造成的损伤较大，手术后常易导致粘连复发。TCRA术后重度宫腔粘连的高复发率及生育问题仍是临床上急需解决的难题。Berman等认为术前粘连的严重程度与宫腔整体情况很大程度上决定了患者术后生育能力的恢复[71]。子宫内膜的再生能力很可能与个体基因相关。中南大学自主研制的宫腔粘连治疗装置，能使子宫前后壁完全分离，动物实验证实具有很好的生物及细胞相容性[72]，一旦应用于临床，可能解决粘连复发的难题。随着成体干细胞研究的不断发展，成人干细胞治疗可能解决TCRA术后子宫内膜缺损的修复问题，为宫腔粘连提供一种新的研究机制及治疗靶向。参考文献[1] Deans R，Abbott J. Review of intrauterine adhesions[J]. Jminim Invasive Gynecol，2010，17(5)：555-569.[2] March C M. Asherman,s syndrome[J]. Semin Reprod Med，2011，29(2)：83-94.[3] 廉红梅，王燕，郎雁. 宫腔镜防治人工流产术后宫腔粘连的时机探讨，临床急诊杂志，2012，3(13)：196-198. [4] Nishi Y，Takeshita T. Asherman syndrome[J]. Nippon Rinsho，2006，Suppl2：418-421.