狼疮性肾炎临床病理免疫病理及相关因素分析

前言
　　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是最常见的自身免疫性疾病，主要发生于育龄期女性，总体性别比例女性：男性为7～9.5:1，育龄期比例可以达到11:1。尽管80%的系统性红斑狼疮发生于育龄期（15～40岁）女性，但儿童、青少年、老年及男性也可发病。SLE发病机制仍未完全清楚，一般认为，遗传因素（组织相容性抗原、细胞因子、细胞因子受体等表达的不同）、环境因素（药物、毒物、饮食、感染等）、免疫调节功能紊乱、性激素的影响等均参与发病。其免疫发病过程中不仅有T细胞参与，同时伴有B细胞的高度活化，血清中可以出现多种自身抗体，在狼疮性肾炎的发生、发展过程中占有非常重要的地位，通过自身抗体-自身抗原的相互作用，引发一系列免疫反应，累及全身多个系统、多脏器、以血管炎为特征的弥漫性自身免疫性疾病。
　　　肾脏为系统性红斑狼疮最常累及的器官之一，即狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN），是SLE最主要的并发症，有研究报道LN是我国最常见的继发性肾小球疾病，约占肾小球疾病的12%，占继发性肾小球疾病的70%左右。LN患者的临床、病理表现多样化，免疫发病机制也各不相同。LN肾脏病理改变具有不典型性和多样性，可从轻微病变到弥漫增生，晚期发展为肾小球硬化。历来所认识的LN的基本发病机制是免疫复合物型病变，在狼疮性肾炎肾小球的免疫复合物沉积既可能是循环免疫复合物所致（弥漫增殖型）也可能是原位免疫复合物形成（膜性病变）。除此之外，寡免疫沉积物的血管炎的病变是局灶节段性病变的特点，弥漫增殖性LN以及有严重肾小球炎症的病例亦可见血栓性微血管病变。不同类型其在组织形态上、病变发生机制上各不相同，在治疗上的方法及效果自然也存在着差异，其远期预后亦不相同。有研究报道系统性红斑狼疮患者10年内约有50～60%的患者出现肾脏损害，其5年生存率约为95%，10年生存率为92%。并且肾脏损害是影响SLE患者远期预后的重要因素。因此分析LN的临床、肾脏病理及免疫学异常的相互联系，有助于认识肾脏病变程度，为治疗提供依据。本文就狼疮性肾炎患者不同临床特征、病理类型与实验室检查指标之间的特点及其相互联系，对123例狼疮性肾炎患者进行回顾性总结。
资料与方法
研究对象
1999年1月至2013年10月期间，在兰州军区乌鲁木齐总医院肾脏病科室住院治疗，根据患者临床表现、实验室检查、肾穿刺活检确诊为狼疮性肾炎的患者123例，其中男性17例，女性106例。
纳入标准：⑴符合1997年修订的美国风湿病协会（ARA）关于SLE的4条或4条以上的诊断标准[8]（见表1）；⑵有肾脏损害的临床表现，如蛋白尿（定量＞0.5g/24h）、肾小球源性血尿、管型（包括为红细胞管型、血红蛋白管型、颗粒管型或混合管型），或伴有肾功能不全；⑶均行肾活检及肾脏病理学检查；⑷有完整的临床、病理及实验室检查记录。
排除标准：⑴排除其他原因引起的蛋白尿和肾功能异常的患者；⑵排除未行肾活检及肾脏病理学检查的患者；⑶临床、病理及实验室检查记录不完整的患者。
研究方法
统计及观察项目
　　　患者的性别、年龄、肾外表现（包括发热、高血压、关节炎、皮肤红斑、水肿、脱发、口腔粘膜溃疡、光敏感、雷诺现象、胸膜炎、心包炎、精神症状）、血常规、血尿素氮、血肌酐、血浆白蛋白、血清补体C3、C4、自身抗体（抗核抗体、抗-dsDNA抗体、抗-Sm抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体）、尿沉渣分析、24小时尿蛋白定量。
实验室指标
尿液检查
　　　尿红细胞形态，取正常清洁中段晨尿10ml，离心机1000r/min离心5min后，弃上清液9.5ml，将0.5ml沉渣液混匀，滴入血球计数池，显微镜下观察红细胞计数。多形态红细胞计数≥10万/ml定义为肾小球源性血尿。
　　　24h尿蛋白定量采用双缩脲法测定。标本收集要求从即日8:00解去小便后，其后至次日8:00的所有小便皆留取在容器内，容器内并加入甲苯10ml防腐，所留尿即为24小时尿量。取5ml尿液加0.15mol/LH2SO42.5ml，加1.5%Na2WO42.5ml，加50%HAC0.5-1.0ml，充分混合，静置10min。离心机3000r/min离心沉淀10min，弃上清保留沉淀，加生理盐水1ml混匀，使沉淀的蛋白溶解，即为测定管。空白管加生理盐水1ml，标准管加标准血清蛋白50ul、加生理盐水至1ml。各管加双缩脲试剂4ml，充分混匀，37℃水浴10min，然后751分光光度计比色，波长540nm，1cm比色杯。根据公式求得24h尿蛋白总量（g）=测定管吸光度/标准管吸光度×2.5×1/测定管尿量（ml）×24小时尿量（ml）/1000。其中尿蛋白定量≥0.15g/24h定义为蛋白尿，尿蛋白定量≥3.5g/24h定义为大量蛋白尿。
血液检查
　　　血红蛋白定量采用高效液相色谱测定；白细胞和血小板采用五分类细胞分析仪；血肌酐采用肌氨酸氧化酶法；血胱抑素C水平测定采用免疫比浊法。
免疫学检查
　　　患者抗核抗体（ANA）、抗ds-DNA抗体采用间接免疫荧光法（IIF）检测，抗核小体抗体（AnuA）、抗Sm抗体、抗组蛋白抗体（AHA）采用免疫印迹法检测，以上试剂盒均购自德国EUROIMMUN公司。严格按试剂盒说明书操作，酶标仪测定吸光度，测定波长为450nm，以吸光度和标准品浓度做标准曲线，求待测血清抗体浓度。
肾组织穿刺活检及病理分型
肾活检方法
采用B超引导下经皮负压式肾活检术，所取肾组织分为三部分，按常规方法进行光镜（LM）、免疫组化（荧光或酶标：IgA、IgM、IgG、C3、CoⅣ）和电镜（EM）检查。
病理分型
参照2003年ISN/RPS有关LN病理分型方案确定病理类型[9]（见表2），将LN分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型。Ⅳ型如伴有弥漫膜性病变（LM显示肾小球基膜外侧广泛嗜复红物沉积或钉突，IF显示免疫球蛋白和补体沿肾小球基膜细颗粒沉积或EM显示膜外侧电子致密物沉积或钉突形成）则称为Ⅴ+Ⅳ型。Ⅴ型如伴有肾小球节段增生性病变如袢坏死、新月体或节段袢内增殖性病变且受累肾小球不足50%，则称为Ⅴ+Ⅲ型。本研究未包括I型和Ⅵ型病例。
临床分型：⑴无症状肾炎型：临床症状轻，单纯血尿或（和）少量蛋白尿（＜3.5g/24h），无水肿、高血压等临床表现；⑵肾炎综合征型：少-中量蛋白尿（＜3.5g/24h），伴血尿、管型尿，可伴有水肿、高血压、肾功能不全；⑶肾病综合征型：大量蛋白尿（≥3.5g/24h）、低白蛋白血症（≤30g/L）、高脂血症、伴有浮肿；⑷肾功能不全：血肌酐水平持续升高（Scr＞113umol/L），可伴有贫血、高血压、水肿。
狼疮性肾炎活动指数（SLEDAI）：按美国风湿协会（ACR）推荐的系SLEDAI[10]评估患者病情（见表3）。SLEDAI评分总分＞9分者为SLE活动期。
统计学方法
　　　所有数据用SPSS19.0统计软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，计数资料采用百分构成比（%）表示，计量资料多组间比较采用方差分析，计数资料间比较采用卡方检验、Spearman秩相关分析，P＜0.05是有统计学意义。
SLE以机体产生大量的抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）、抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗核小体抗体（anti-nucleosome antibody，AnuA）、抗组蛋白抗体（anti-histone antibody，AHA）等多种自身抗体为特征，大部分自身抗体没有器官特异性。抗核抗体对SLE诊断敏感性为95%，但特异性相对较低。早期的报道认为，DNA大分子存在于循环或黏附于多种器官的微血管结果，如肾脏、肺、脑，这些循环或器官原位抗原DNA均可与循环自身抗体发生反应，形成免疫复合物，激活炎症系统，导致器官组织损伤，认为抗ds-DNA抗体是致病介质，这些血清抗体水平与肾损伤的严重程度呈正相关。后期有研究对此提出质疑，因为并非所有LN患者抗ds-DNA抗体阳性，抗ds-DNA抗体单独不足以导致肾小球肾炎发生。近年来，核小体的致病作用愈来愈引起人们的重视。在细胞凋亡的过程中，凋亡细胞出现许多核小体或碎片，这些隐蔽的细胞核抗原经修饰后离开细胞而进入外周血，作为免疫原诱导机体免疫系统产生核小体特异的肾炎抗体[39]。狼疮鼠模型的实验研究表明，核小体是LN小鼠的主要免疫原，它不仅能诱导出抗核小体抗体，而且还能诱导出抗ds-DNA和抗组蛋白抗体。在SLE患者血清中，抗核小体抗体的出现明显早于抗ds-DNA抗体，其特异性与敏感性亦高于抗ds-DNA抗体。目前越来越多的学者研究抗ds-DNA抗体与其他自身抗体联合检测，以提高对LN的诊断以及LN的活动度的判断。汪国生等[41]研究发现抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体、抗核小体三种抗体的阳性率在LN组中明显高于非LN组，差异有统计学意义。同时发现三种抗体与SLEDAI、血沉、IgG球蛋白水平显著正相关，与C3、C4及白蛋白水平显著负相关，抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体、抗核小体抗体三种抗体联合检测可以提高疾病活动检出率。Moura等研究也发现SLE患者血清中抗ds-DNA抗体、抗C1q抗体、抗核小体抗体等抗体水平与LN的临床表现和活动性指标有密切联系。本研究中患者ANA、抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体阳性率分别为96.7%、67.5%、37.4%、41.5%、35.8%，不同肾脏病理类型LN患者血清免疫学改变无显著性差异，与国内研究报道基本一致[14]。其中抗ds-DNA抗体阳性患者中88.2%的抗核小体抗体阳性、86.4%的抗组蛋白抗体阳性。抗ds-DNA抗体、抗核小体、抗核抗体三种抗体均阳性33例患者其病理类型分布无明显差异（P=0.221），96.97%的患者SLEDAI计分＞9分，其中90.9%处于重度活动期。在LN中联合检测抗ds-DNA抗体、抗核小体、抗组蛋白三种抗体对LN患者活动性监测有重要意义。
　　　LN病变主要由于免疫复合物沉积，肾小球免疫荧光通常为IgG优势沉积，并出现C4、C1q与C3共沉积。当IgG、IgA、IgM以及C3、C4、C1q均高度的沉积于系膜区和毛细血管壁，称为“满堂亮”现象。C1q阳性往往提示狼疮性肾炎的诊断，肾小球免疫荧光染色的性质和分布特点，为狼疮性肾炎的诊断提供重要信息。在本研究中26.0%的患者肾组织免疫荧光呈现“满堂亮”，以IgG阳性率最高（91.5%），但肾组织中有IgA沉积者亦不少见（85%）。目前有很多研究报道关于肾组织有IgA沉积的LN与IgA肾病的关联，是SLE合并IgA肾病或IgA沉积为SLE本身的表现，至今仍有争议。但多数学者认为LN病理分型包括6种类型，不包括IgA肾病，当患者同时存在SLE和IgA肾病时，他们侧重于IgA肾病并发SLE。2010年有学者提出IgA肾病是狼疮的一种特殊类型表现，LN病理可转变为IgA病变，正如LN病理类型间发生转型。国内刘红艳等[48]研究报道，5例SLE患者以IgA沉积为主不伴有IgG、C1q，肾活检病理荧光显微镜与典型LN病理不相匹配，与IgA肾病相比发病年龄较大、女性多于男性、无感染史，血清IgA水平发生率低，提出肾组织主要为IgA沉积的非典型LN患者，可能是SLE的临床亚型。IgA肾病患者无性别差异，发病年龄多在16～35岁，22-60%的患者伴有IgM沉积，80%伴有C3沉积，40-50%的患者出现发作性肉眼血尿。在本组研究中12例肾组织无C1q沉积者中均以IgA沉积为主，均伴有IgM沉积，伴有C3沉积者4例（33.3%）；12例非典型LN患者其性别均为女性、发病年龄26.25±4.94岁，其临床表现发热者3例（3.9%）、脱发者4例、口腔溃疡者2例、关节炎者4例、贫血者7例（6例为轻度贫血、1例重度贫血）、肉眼血尿者2例、大量蛋白尿者2例，其临床表现与IgA肾病不相符合。本研究亦认为SLE和IgA肾病可同时共存，但仍不能确定为IgA肾病并发SLE，还是SLE并发IgA肾病；主要为IgA沉积的红斑狼疮患者其肾脏病变可能为SLE的另一种临床分型。但目前仍没有IgA与LN相匹配的免疫标志物，有待进一步研究。
小结
LN患者肾脏病理以Ⅳ型最常见，其次为Ⅱ型。男性患者以重型LN常见。
LN患者临床表现为大量蛋白尿、贫血、血胱抑素C升高的LN患者其肾脏损害较重。
LN患者SLEDAI计分多处于活动期，与肾脏损害程度无明显相关性。
抗ds-DNA抗体、AnuA、抗组蛋白三种抗体是SLE活动的指标，联合检测疾病活动性有重要意义。
肾脏病理以IgA沉积为主的狼疮患者其肾脏病变可能为SLE的另一种临床分型。