慢性淋巴细胞白血病患者临床资料分析和外周血调节性T细胞的百分

前言
　　　慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）是我国较为少见的恶性骨髓造血系统疾病，它的特点是骨髓中产生大量单克隆不成熟的淋巴细胞，通过血液传播至全身并浸润淋巴组织、脾脏等器官。该病是病程不一，进展较为缓慢的恶性血液系统疾病，随着病程的变化，患者会出现明显而非特异的临床症状和（或）体征如贫血、乏力、出血倾向、感染及器官浸润（深浅淋巴结肿大、脾大）等。CLL以克隆性B细胞形式增殖。B淋巴细胞被其激活[1]。这种细胞表面几乎均表达CD19、CD5、CD23，反而降低了免疫球蛋白M、免疫球蛋白D、成熟免疫表型的膜表达水平。CLL在欧美国家是最为常见的一种骨髓造血系统异常的疾病，中老年男性最为多见。患病的中位年龄大约在70岁，发病年龄小于40岁的患者少见[2]。CLL是一种惰性淋巴瘤，多数患者可以数月至数年保持无临床症状及不适体征，一般患者的中位生存时间为10年左右，但是患者的疾病进展过程及治疗效果、预后具有高度异质性。部分病程进展缓慢的患者，早期治疗或过于积极治疗并不能延长患者生存期，反而增加治疗的不良反应，甚至可能缩短生存期。
　　　CLL预后的评估及判断的指标除了经典的临床分期（Rai和Binet分期），近几年还提出CLL的几个新的预后指标包括：Ig重链变量(Ig heavy chain variable ，IGHV)区域的基因突变状态，CD38分子的表达、ZAP-70分子的表达、β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG)、乳酸脱氢酶、细胞遗传学改变、端粒长度和端粒酶活性等。2009年NCCN诊疗指南将t(11q;v)、del(11q)、del(17p)、+12、del(13q)确定为预后指标，17p13、del11q22和14q32基因缺失者预后差，正常核型和12号染色体三体者预后中等，del(13q)者预后好。许多研究表明未突变IgVH基因CLL患者预后不良；CD38、ZAP-70的阳性表达也与CLL不良预后有着密切关系[3]。
　　　Mellstedt等[4]发现CLL造成外周血异常。他的研究揭示出CLL患者外周血会出现部分T细胞亚群数量及功能出现异常情况。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的主要参与了维持免疫自稳，调解外周耐受，防止自身免疫等生理过程。实现其生理过程主要是通过直接与其他类型免疫细胞相互作用或通过免疫抑制因子抑制免疫应答。它是T淋巴细胞的一个子集[5]。它的主要形式有两种：天然性Treg（natural Treg，nTreg)和可诱导性Treg(induced Treg,iTreg)。一些证据表明Treg细胞也可以调节宿主T细胞活动，防备肿瘤相关抗原，从而促进肿瘤免疫逃逸[6-7]。Treg细胞可以定义为CD4+T细胞，在它们表面表达高水平的CD25（IL2-受体）和细胞质的FoxP3，极少或不表达CD127（IL7-受体）[8-12]。CLL的发生与发展很大程度上受CLL患者机体免疫状态的影响。CLL的发生与T细胞异常有关[13]。除了多种免疫介质和免疫细胞与CLL的发病机制有关外，近期的研究学者们还发现，调节性T细胞的异常也参与了CLL的发生和发展。它的数量异常CD8+T细胞有关[14]。CLL患者血液中CD8+T细胞大量表达会造成T细胞增多，从而导致CD4/CD8比值下降。然而，近几年一些研究结果也证实了CLL患者外周循环血液中调节性T细胞数量增加[15-19]，但是在不同子型的CLL中Treg细胞的确切作用，各种Treg细胞亚群详细的情况和它们的作用是难懂及不明确的。
　　　尽管众所周知Treg细胞与晚期疾病有着密切的联系，在晚期疾病中都会发现Treg细胞的数量、表达水平等的异常。但它与CLL预后关系鲜为人知[20]。Weiss[21]等认为Treg可作为CLL预后的指标。他们发现循环T细胞数量可能有助于预测中低危CLL患者治疗的需要。目前调节性T细胞数量和功能异常可能是导致CLL发生、发展的致病因素之一，但Treg细胞在CLL免疫功能失调中是否起着关键性的作用，还是CLL发病后出现的一种现象，仍然存在争议[5,22]。Treg细胞的调节可能是一个有助于对抗癌症的有效工具。众所周知,Treg细胞的消耗可以通用环磷酰胺诱导[23]。其他传统抗肿瘤药物如甲氨蝶呤、米托蒽醌等也能够影响Treg细胞的调节。然而对于调控Treg细胞这是最好的办法（抑制或损耗）吗？对于这个说法迄今尚不清楚[24]。鉴于此，Treg的靶向疗法也成为迄今研究热点[25-26]。CLL患者通过常用药物治疗，预后可能可以得到一定的改善，但除造血干细胞移植外，目前尚无有效治愈CLL的方法。本研究归纳总结初诊患者的临床资料并采用流式细胞术(Flow cytometry，FCM）检测初诊CLL患者、治疗后缓解的患者及健康对照者外周血中Treg细胞的数量，比较各组之间Treg细胞数量的差异性和它与CLL预后因素之间的关系，初步探讨Treg细胞在CLL中可能的作用机制以及与预后的关系，期望对今后CLL免疫干预治疗提供新的依据。

研究内容与方法
1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 对象选择和资料收集 28例CLL病例来自新疆医科大学第一附属医院自2011年10月至2013年03月住院的初诊患者。所有病例的确诊、临床分期（Rai和Binet分期）均按照2011年中国慢性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南[27]。28例CLL病例中有22例男性患者，6例女性患者，男女之比约为4:1（22/6），年龄范围在38至79岁之间，中位年龄为65岁。并随访这28例病例，其中治疗19例，失访1例，死亡1例，未治疗7例。健康成年人30例，男18例，女12例，年龄范围36~69岁，中位年龄59岁，男女比例约为1.5:1（18/12）。记录初诊CLL患者的临床资料，包括年龄、性别、首次就诊原因、初次淋巴结肿大及部位、脾脏肿大、肝脏肿大、骨髓象及骨髓病例免疫组化、免疫分型、外周血白细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数及淋巴细胞计数、淋巴细胞比例、β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）、Zap-70、IgVH基因分型、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测结果、CD38表达、临床分期及治疗方案等。
1.1.2 主要试剂和仪器 PerCP标记的小鼠抗人CD4单克隆抗体（mAb）、FITC标记的小鼠抗人CD25抗体、PE标记的小鼠抗人Foxp3抗体、PE-Cy7标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体、PerCP标记的小鼠抗人CD45单克隆抗体、FITC标记的小鼠抗人CD19单克隆抗体、APC标记的小鼠抗人CD38单克隆抗体均为eBioscience公司产品。MACSQuant流式细胞仪为Miltenyi Biotec公司产品。将4×固定/穿透浓缩液和固定/穿透稀释液（eBioscience公司）按体积比1:3配制成1×固定/穿透(现配现用, 每一份样本需要1×固定/穿透1 mL)。准备：用移液器取10×穿透缓冲液1ml，加入9ml去离子/蒸馏水，充分混匀，配制成1×穿透缓冲液。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 Treg细胞标本制备
（1）收集受检者清晨空腹时的外周血4mL, 置于无菌EDTA抗凝管内。
（2）用PBS以1:1对抗凝血进行稀释，然后用Ficoll分离出单个核细胞，调整细胞密度为2×106个/mL。
（3）每离心管中加入100μL的血液单个核细胞悬液；实验组离心管中在核细胞悬液的基础上加入5ul PerCP标记的小鼠抗人CD4mAb，再取5ulFITC标记的小鼠抗人CD25mAb一同加入到细胞悬液中，充分混匀后快速4℃避光孵育30 min；空白组离心管中只加入100ul的血液单个核细胞悬液，作为空白对照。
（3）将实验组和空白组离心管都用预冷的PBS缓冲液洗涤、离心；除去上清液, 重悬细胞。 每管中加入1 mL新鲜配制的1×固定/穿透缓冲液，用漩涡混匀器混匀，4℃避光孵育30 min。
（4）用2 mL 1×穿透缓冲液洗涤、1500转，离心5min，然后弃上清液；本步骤重复1次。
（5） 实验组离心管中加入80 μL穿透缓冲液后，再加入PE标记的小鼠抗人Foxp3抗体5 μL，空白组离心管中只加入大鼠IgG2a作为同型对照。
（6） 4℃避光孵育30 min; 用2 mL 1×穿透缓冲液洗涤、1500转，离心min，去除上清液，本步骤再重复一次。
实验组和空白组均加适量流式细胞术染色缓冲液, 上机分析。
1.2.1.2 CD38标本制备
取CLL患者治疗前肝素抗凝的骨髓1mL,用PBS以1:1稀释抗凝骨髓，用Ficoll分离出单个核细胞，调整细胞密度为2×106个/mL。每管加入100 μL细胞悬液；加入抗人单克隆抗体(CD45-PerCP﹑CD19-FITC、CD38-APC)各20 μL, 避光孵育15 min；再加入红细胞裂解液1 000 μL, 振荡后混匀, 避光孵育5~ 10 min。1500 r/min离心5 min后小心弃除上清。加入1mL PBS冲洗沉淀后，再次1500 r/min离心5 min，弃除上清。加入500ulPBS后用枪头轻轻吹打直到混匀，然后上流式细胞仪进行检测。
1.2.2 流式细胞检测 在FSC/SSC双参数散点图上选定淋巴细胞群, 以CD4+细胞和SSC设门, 选择CD4+细胞分析CD25和Foxp3的表达,分析其中CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞所占CD4+淋巴细胞的比例。以CD19+细胞和SSC设门分析CD38表达。
1.2.3 临床分期 根据患者血常规、骨髓、症状体征及淋巴结肿大部位、数量等进行分期。
1.2.4 统计学分析 应用SPSS17.0软件统计分析数据。采用均数±标准差方式描述定量资料。应用t检验比较组间差异，方差不齐时采用t’检验。Treg细胞与预后因素如：CD38、β2-MG、Zap70、Binet分期等，采用Pearson或Spearman相关分析。P <0.05为有统计学意义。临床分期是众所周知的预后因素，也是经典的预后指标，分期越倾向中晚期或高危期预后越差、生存期越短。本研究中Binet A期患者CD4+CD25+Foxp3+ Treg低于B/C期，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量与CLL的Binet和Rai临床分期均呈正相关，表明CLL患者Treg细胞数量增多，且分期越倾向中晚期或高危期预后越差，提示Treg数量与CLL疾病的进展有着密切的关系，推测高危患者Treg细胞抑制功能较低危患者降低，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，缩短患者的生存期。Jadidi-Niaragh[36]等也表明Treg与CLL的疾病进展密切相关。因此若动态监测患者Treg细胞数量时，其突然升高是否预示着疾病恶化，有待于进一步研究。现已将FISH检测结果作为CLL预后指标之一。若检测结果中有del17p13、del11q22和14q32其中的任一种细胞遗传学异常的患者预后差，生存期短。CLL最可靠的预后指标是IgVH基因 [37]。但本研究发现它们与CD4+CD25+Foxp3+Treg数量间无相关性，考虑与样本量少有关，需扩大样本量，加强对它们的检测，进一步验证实验结果的准确性。　　综上所述，初诊CLL患者外周血Treg细胞数量增高，在治疗后有所降低，且CD4+CD25+Treg细胞与预后因素ZAP70、β2-MG、Rai临床分期呈正相关，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞与预后因素β2-MG、CD38、Zap70、Binet分期、Rai分期呈正相关，以上进一步说明Treg细胞与CLL的免疫失调有关。进而推测Treg数量增加可能与CLL患者全身性T细胞系统免疫功能调节障碍有关，Treg细胞对CLL的病情评估、治疗效果及预后判定有一定的临床指导价值，本研究将进一步探索CLL患者体外免疫干预试验，为CLL免疫治疗的研究奠定理论基础。小结[1] 本地区绝大多数病人就诊时已出现临床症状和（或）体征。血红蛋白、β2-MG在Rai 0~Ⅱ期患者与Ⅲ~Ⅳ期患者中有明显差异，其他常规实验室检查两组间比较无统计学意义。[2] 在CLL患者治疗前后，Treg细胞均高于健康者；在治疗前后比较中，治疗前Treg细胞高表达。[3] 在Zap70表达中，阳性患者Treg细胞高表达；在Binet分期中，B/C期患者高表达Treg细胞。[4] Treg细胞与预后因素β2-MG、CD38、Zap70、Binet分期、Rai分期呈正相关。