【摘要】目的：观察灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液（AHP）对大鼠进行肌肉注射以建立阳虚大鼠模型，比较运用灵龟八法开穴灸与穴位（足三里、肾俞）温和灸对模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+变化的影响。结果：灵龟八法开穴灸组和足三里、肾俞温和灸组模型大鼠与正常组大鼠外周血CD4+/CD8+比值变化无明显差异。结论：灵龟八法开穴灸法可以提高阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞免疫功能。
【关键词】阳虚模型,灵龟八法，足三里，肾俞，T淋巴细胞亚群。
中医学认为，阳虚是指机体阳气偏衰、正气不足，从而表现出一系列机能衰退，代谢减弱的病理状态[1]。研究显示免疫系统功能低下属于阳虚的范畴。CD4+、CD8+是T淋巴细胞的亚群，其比值是反映免疫系统功能状况的重要指标之一。大量临床实践表明灸法对治疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种按时开穴的方法是中医学整体观念的重要体现，能提高针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探讨灸法防治阳虚证的免疫学机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用SD大鼠50只，230g～280g（SPF级，武汉大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(鄂）2008-0004），雌雄兼用。
1.2主要药品与试剂
醋酸泼尼松龙注射液（AHP)：125mg/5ml浙江仙琚制药股份有限公司（国药准字H33020824,生产批号120912）；艾灸条：南阳市绿佳艾绒厂；FITC（一硫氰酸荧光素）标记小鼠抗大鼠CD4单克隆抗体、PE（藻红蛋白）标记小鼠抗大鼠CD8单克隆抗体、APC（别藻蓝蛋白）标记小鼠抗大鼠CD3单克隆抗体：美国eBiscience公司产品；红细胞裂解液，武汉谷歌生物科技有限公司产品，货号：G-2015；胰酶Trypsin，Amresco公司产品，货号：0457；0.9%氯化钠注射液；1%肝素钠注射液；自配PPS液等。
1.3主要仪器设备
FACsort流式细胞仪(美国BD公司）、飞鸽TD2SO-2H离心机（上海安亭公司）、SW-CJ-1FD洁净工作台（苏净安泰公司）等。
1.4实验方法
1.4.1 阳虚大鼠模型的建立
选用SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准进行大腿外侧肌肉注射AHP，连续5天。大鼠出现背部拱起、身体蜷曲、四肢尾冷、蜷缩在一起、神情疲惫、反应呆滞、被毛疏松、暗淡无光、身体消瘦、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发脱落等虚损症状[1]。根据中医八钢辩证之阳虚证，辨证参考标准[2]，类似“阳虚”状态，说明此次试验所建立的阳虚大鼠动物模型属成功模型。
1.4.2 实验动物分组
将建立好的阳虚模型大鼠按随机数字表随机分组，建立好的阳虚模型大鼠不予干预视为阳性空白对照组(A组)，足三里、肾俞温和灸组(B组)，灵龟八法开穴灸组(C组)，灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组(D组)，正常大鼠视为阴性空白对照组(E组)，共5组，每组10只，雌雄分养。
1.4.3 治疗方法
B、C、D组大鼠每天每穴温和灸15分钟，左右交替进行，连续2周。灵龟八法开穴法依据《子午流注与灵龟八法临床应用盘》(魏晋盛主编，山西科学技术出版社，2010年10月，第一版)简易法选穴。A、E组大鼠只抓取，不做治疗。
穴位定位：“足(后)三里”穴(双)，定位于后肢胫骨粗隆外膝至踝间上1/5处[3]；“肾俞”穴，定位，首先用手触摸到大鼠背部脊柱及两旁的肋骨，在肋骨结束的水平，定位第十二胸椎，然后往下数二个棘突，左右旁开1Omm(同身寸，大约为人体的1/10)即为“肾俞”穴[4]。灵龟八法开穴所需其它穴位定位参考李辞蓉等编著的《大鼠针灸穴位图谱的研制》。
1.5 观察指标及检测方法
1.5.1血液标本
采用心脏采血法收集实验大鼠血液2ml快速放置在EDTA抗凝管中，以避免采集的标本发生溶血和凝血现象。
将收集的血液放入离心机，进行3000转每分钟离心10分钟，并取上清液置于1.5mlEP管中，
标记后放入-20℃冰箱中保存。
在离心后的血液沉淀加入3ml1×红细胞裂解液，摇匀后静置15分钟。放入离心机进行1500转每分钟离心5分钟，弃去上清液。次操作需重复两次。
1.5.2细胞标本
（1）收集培养液于流式管中，此时的培养液中有少量悬浮细胞。
（2）六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞
悬浮，即加入PBS缓冲液终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，
进行每分钟1500转离心5分钟，之后弃上清。
（3）加入3ml 4℃预冷的PBS缓冲液中重新悬浮细胞，1500转/分钟离心5分钟，弃上清。
（4）沉淀加入100μl4℃预冷的PBS重悬细胞。
（5）加入荧光标记的一抗2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。
（6）每分钟1500转离心5分钟，弃上清。
（7）加入3 ml PB重悬细胞，1500转离心5分钟，弃上清。
（8）沉淀加入100μl预冷的PBS，重悬细胞。
（9）加入荧光二抗2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。
（10）每分钟1500转离心5分钟弃上清，加入3ml PBS洗一次，加入100μl PBS 重悬。样品上
机，PI通道（FL2）检测红色荧光。
1.6 统计学方法
对各组计量资料进行方差分析，组间两两比较采用Lsd-t检验。以上统计分析运用SPSS 19.0统计软件完成。
高希言等[111]选用D-半乳糖造成亚急性衰老小鼠为实验模型，随机分为艾灸督脉“大椎”“命门”“百会”穴组，空白对照组，与非经非穴部位作对照组，观察各组衰老小鼠的胸腺和脾脏指数、T细胞亚群中CD3+百分率、CD4+百分率、CD8+百分率以及CD4+／CD8+比值、可溶性IL-2受体含量。发现各造模组小鼠免疫功能较正常小鼠降低(P<O.O1)。督脉穴组小鼠的胸腺、脾脏指数和免疫功能增强，与模型组相比差异有非常显著性意义(P<O.01)。李津利【222】等，运用心俞、足三里、三阴交等主穴结合患者临床症状配以相应辅穴，对HIV/AIDS患者进行艾灸治疗。结果表明经5个疗程治疗后，患者乏力、发热、皮疹、淋巴结肿大、咳嗽、腹泻、纳呆等症状均有改善。但是治疗前后T淋巴细胞亚群测试结果经统计学处理，差异无显著性意义(P>0. 05 )。说明灸法治疗HIV/AIDS患者有一定疗效。莫金花【333】等，对缓解期反复呼吸道感染(RRTI)患儿用推拿结合艾灸的方法进行治疗，疗程3个月，观察期为1年。发现试验组治疗后CD3+、CD4+、IgA、IgG水平较治疗前提高，对照组治疗后CD3+、CD4十、CD8+、CD4十／CD8+、IgA、IgG水平较治疗前提高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。对照组治疗后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、IgG改善优于试验组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0．01)。不仅灸法可以提高机体免疫力，不同的灸法也有这不同的影响。翟道荡等【444】艾炷直接灸荷瘤小鼠关元、大椎和中院穴，观察对下丘脑、垂体、肾上腺和血浆β-END含量的影响。发现艾灸可能通过促进垂体β-END的释放，提高血浆β-END浓度，从而发挥免疫调节等作用。张彤【555】等，用艾条雀啄灸“翳风”穴治疗青少年面瘫，灸治一个月后机体CD3及CD4明显升高，CD4 /CD8比值明显改善。唐照亮【666】等用艾条间接灸肾俞穴观察其对佐剂性关节炎大鼠炎症和免疫功能的影响。通过淋巴细胞功能侧定表明艾条灸治组大鼠对ConA.IL-2诱导的脾细胞增殖反应明显高正常组和致炎组(P<0.01)，表明机体免疫应答增强和免疫功能提高。王文莉【777】等用麦粒灸可以提高脾虚泄患者红细胞C3b受体花环率、降低红细胞免疫复合物花环率、CD4值和血清SIgA含量。
灸法对IL-2的影响研究
李丽红【888】等将60只SD级清洁大鼠机分为青年对照组、衰老模型组、艾灸组、中药组、艾灸加中药组。皮下注射D-半乳糖建立衰老大鼠模型。治疗40天后发现衰老模型组大鼠肝血清IL-2含量与青年对照组相比明显减少（P<0.05)。与衰老模型组相比外周血IL-2含量明显增加（P<0.05)。说明艾灸与中药均可提高大鼠外周血IL-2含量，从而达到加强免疫力的作用。唐照亮【999】等，观察艾灸对佐剂性关节炎大鼠抗炎消肿性作用，发现艾灸大鼠足三里，肾俞穴可以降低大鼠TNF,NO,IL-1含量，提高IL-2水平。除了IL-1外，其余指标均与模型组有着显著的差异性（P<0.05)。说明艾灸足三里，肾俞穴可以调整机体免疫紊乱及自由基代谢失衡。同样，陈晓莉【1010】等，通过观察麦粒灸对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响，发现结果模型组大鼠腹腔巨噬细胞IL-1,IL-6的活性比正常大鼠明显升高(P<0. O1)。麦粒灸组大鼠IL-1,IL-6活性较模型组比明显下降(P<0. 05)。麦粒灸加去肾上腺组IL-1,IL-6活性未见明显变化(P>0.05).假手术组IL-1活性极显著降低(P<0. O1)。IL-6比模型组明显为低(P<0. 05)。模型组大鼠脾脏IL-2活性降低(P<0. 05)，麦粒灸治疗后可使IL-2活性极显著升高(P<0. O1)，麦粒灸加去肾上腺组IL-2活性与麦粒灸组及假手术组比(P<0.05)，但与模型组比无显著性差异(P>0.05)。假手术组IL-2活性亦明显提高(P<0. O1)，而与正常组无差异。得出结论，麦粒灸可抑制AA大鼠IL-1,IL-6活性。摘除肾上腺后则麦粒灸不能降低IL-1,IL-6活性;麦粒灸可明显提高IL-2活性，摘除肾上腺后麦粒灸则对IL-2活性无明显影响;麦粒灸对AA细胞免疫功能的调整与下丘脑一垂体一肾上腺的完整有关。
选穴依据
足三里适应症众多，临床应用广泛。足三里又被称为下陵，鬼邪，中俞髎是胃经的下合穴，属于“四总穴”著名的“回阳九针”之一。此穴始载于《内经》，仅在《灵枢》中有关其主治运用的记载即达15处之多。随着针灸学的发展，其功效逐渐丰富，历代对其主治记载日广，《古法新解会元针灸学》曰：“此穴治病万端，有白术之强，有桂附之热，有参茸之功，有硝黄之力”，故而成为临床常用要穴，历来就被推崇为补虚培元之要穴。孙思邈的《千金要方》曰：“若要安，三里常不干”。《针灸资生经》:“若要安、丹田三里不曾干。”《灵枢·热病》曰:“中有寒，取三里”。《灵枢·四时气篇》:“着痹不去，久寒不已，卒取其三里。”华佗云:“五劳赢瘦，七伤虚乏，大小人热，皆调三里。”《针灸真髓》云:“三里养先天后天之气。”关于此类的论述在我们诸多古代医籍中比比皆是，说明足三里历代就被推崇为健脾补虚之要穴。它不仅可以作用疾病的反应点帮助诊断，也是治疗多种疾病的主穴，要穴。它对于机体的调节作用是双向的，“太过”可泻之，“不及”可补之。
中医学认为,肾藏精,生髓。肾俞穴系肾在背部之输穴，位于十四椎之旁，穴近肾脏而内应肾，是肾气转输、输注之所，为治肾之要穴，有益肾填腰、固精补虚、壮阳利湿、健脑明目之功，临床常用于治疗由肾虚(包括肾阳虚)引起的各种病症。《素问·阴阳应象大论》曰:“肾生骨髓”，是因髓乃是肾之精气所化，肾主骨，髓养骨。所以，有人提出了“肾气-免疫”系统的概念[86].也正是基于现代医学研究发现免疫活性细胞的主要组成部分，由其是T淋巴细胞，正是由骨骼的造血细胞衍生而成。【80]。
综上所述，足三里穴是阳明胃经之合穴，有调脾胃、养气血、扶正
壮阳之功，可以顾及“后天之本”;肾俞穴是脏腑气血汇聚的背脑穴，能补肾气、益阴阳、强腰健骨，顾及“先天之本”。两者合用，相辅相成，先天于后天兼顾，固本培元，故本实验采用此两穴。
灵龟八法与机体免疫功能的关系
灵龟八法
模型评价
流式细胞术的选择
在临床上，外周血CD4+, CD8+T淋巴细胞的绝对计数对于评价患者免疫功能和监测免疫抑制剂的使用有着重大的意义。本实验对大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+检测方法，选用的是流式细胞术。流式细胞术(FCM)是用一种在功能水平层面对单个细胞或生物粒子进行定量分析的检测手段。是细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的综合结晶。具有速度快、敏感性高、准确性好等优点[1.2]。
用流式细胞仪检测由于其影响因素较多，很多因素都可能导致结果的偏差，所以在实际操作中一些操作细节必须加以注意，以得到更加稳定可靠，重复性好的结果[121]。在实际操作中应注意以下几点:
1)标本的留取:对抗凝剂的选择十分重要，这一环节直接关系到采取的标本的质量。采用的抗凝剂是1%肝素钠注射液。抗凝剂的计量要与采取的血液的计量比例适当，以保证血液能充分抗凝同时保证血液不被过度稀释。因此有必要在采集血液之前，通过预实验的经验，提前计算好肝素用量的范围。在进行完采血工作后一定要将标本充分混匀，以保证其充分抗凝。
2)标本的送检:标本应在采血后6小时内进行检测。不能及时送检，应及时保存于4℃冰箱中，否则则易出现溶血现象。
试剂的质控:使用试剂前需详细阅读试剂的说明说，操作时一定要严格按说明书执行。在测定时还要时刻注意FS, SS二维散点图，观察白细胞是否较好的分为三群(淋巴细胞，粒细胞，单核细胞)，如分群不好提示前期处理有问题，应寻找原因，必要时及时更换试剂。
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