益气养阴化痰通络中药对糖尿病胃轻瘫大鼠氧化应激及细胞凋亡的影响

摘要目的：糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）是最常见的糖尿病（diabetes mellitus，DM）胃肠道并发症之一，以胃动力障碍和排空延迟为主要特征。据报道27%-65%的1型糖尿病患者及约30%的2型糖尿病患者会出现胃排空延迟，多见于女性患者。胃轻瘫通常会出现在10年以上病史的糖尿病患者中，这些患者通常有自主功能紊乱。DGP主要临床表现为早饱、腹胀、恶心、呕吐、腹痛等症状。
DGP发病机制尚不十分明确，目前认为DGP的发病主要与高血糖状态、自主神经功能失调、胃肠道激素紊乱、肠神经系统神经元减少、Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)缺失、平滑肌病变及微循环障碍等因素相关。Brownlee提出高糖诱导线粒体产生过多超氧化阴离子而发生氧化应激是糖尿病各种并发症的统一发生机制。近来研究发现氧化应激介导细胞凋亡在糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变等多种糖尿病并发症的发生、发展中都发挥了重要作用。但关于氧化应激和细胞凋亡在DGP发病中的关系及具体信号传导途径等方面的研究甚少。
临床上我们采用益气养阴化痰通络中药(黄芪、熟地、鳖甲、积雪草、丹参、大黄、地龙、水蛭、茯苓、砂仁等)治疗DGP取得了较好的疗效。本实验观察高糖诱导的氧化应激状态下DGP大鼠胃动力功能、平滑肌细胞凋亡、凋亡调控基因的表达变化；阐明益气养阴化痰通络中药治疗DGP的作用机理，为中药治疗DGP提供新的理论依据。
方法：健康清洁级Sprague Dawley（SD）大鼠30只，体重201-205g，普通饲料适应性喂养2周后随机分为正常组对照组（NC组）、糖尿病模型对照组（DC组）及益气养阴化痰通络中药组（DZ组），每组各10只大鼠。除正常对照组外，其余各组大鼠按60mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ），正常对照组注射等体积枸橼酸缓冲液。72 小时后尾尖取血测定血糖，以血糖≥16.7mmol/L作为糖尿病模型成功的标志。造模成功后，中药干预组给予益气养阴消癥通络中药10.58g/(kg.d)，正常对照组及模型对照组给予相当剂量的饮用水灌胃。每日给药一次，共6周。于第6周末，禁食16-24小时、禁水2 小时后，予大鼠 500mg/L 酚红溶液 2ml灌胃，15分钟后按2ml/kg体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剖腹，结扎贲门和幽门，取出整个鼠胃，用酚红灌胃法检测胃排空；部分标本置于多聚甲醛固定液中，TUNEL检测胃平滑肌细胞凋亡情况；部分标本保存于-80℃冰箱用于制备组织匀浆、提取 RNA、蛋白标本，检测SOD活性，MDA含量；蛋白印迹（Western blot）检测胃组织HO-1蛋白表达；Real-time PCR检测胃组织HO-1、Bcl-2、Bax 基因表达。
结果：
1 各组大鼠一般状况的比较
   正常对照组大鼠毛色正常，反应敏捷，精神状态良好，体重增加，实验期间没有不良反应，无死亡情况。糖尿病模型组大鼠腹腔注射STZ后渐渐出现多饮、多食、多尿、体重下降，活动明显减少，反应迟钝，精神状态萎靡，实验期间，糖尿病模型对照组死亡2只大鼠。益气养阴化痰通络中药干预后的大鼠一般状况要优于模型对照组大鼠，反应较灵活，精神状态可，实验期间中药干预组没有大鼠死亡记录。
2 各组大鼠体质量及血糖的比较
   与正常对照组大鼠相比, 糖尿病模型对照组和中药组大鼠体质量明显下降(P<0.05)；中药组大鼠体质量与糖尿病模型对照组相比没有明显变化(P>0.05)。与正常对照组相比,糖尿病模型对照组与中药组大鼠血糖水平均明显升高(P<0.05)；中药组大鼠血糖水平与糖尿病模型对照组相比明显下降(P<0.05)。
3 各组大鼠胃排空率的比较
根据各组大鼠胃排空率结果可知：与正常对照组相比，糖尿病模型对照组及中药干预组大鼠胃排空率均显著下降(P<0.05)；与糖尿病模型对照组相比，中药干预组大鼠的胃排空率显著升高(P<0.05)。
4 各组大鼠胃组织SOD活性及MDA含量的比较
   与正常对照组相比，糖尿病模型组及中药组大鼠胃组织SOD活性均明显下降(P<0.05)；中药组SOD活性较糖尿病模型对照组明显升高(P<0.05)。与正常对照组相比，糖尿病模型组及中药组大鼠胃组织MDA含量明显升高(P<0.05)；中药组MDA含量较糖尿病模型对照组有着明显下降(P<0.05)。
5 各组大鼠胃组织HO-1蛋白表达的比较
   与正常对照组比较，糖尿病模型组及中药组大鼠胃组织HO-1蛋白表达均有升高，但中药组升高地更为明显(P<0.05)；与糖尿病模型对照组相比，中药组HO-1蛋白表达显著升高(P<0.05)。
6 各组大鼠胃组织HO-1 mRNA表达的比较
    与正常对照组比较，糖尿病模型组及中药组大鼠胃组织HO-1mRNA表达均有升高(P<0.05)；与糖尿病模型对照组相比，中药组mRNA表达显著升高(P<0.05)，与HO-1蛋白表达趋势一致。
7 各组大鼠胃平滑肌细胞凋亡的比较
   正常对照组平滑肌层甚少见凋亡细胞，糖尿病模型对照组平滑肌凋亡细胞数量明显增多(P<0.05)；中药干预组平滑肌凋亡细胞数量较糖尿病模型对照组明显减少(P<0.05)，但与正常对照组相比仍有差异(P<0.05)。
8 各组大鼠胃平滑肌细胞凋亡调控基因Bcl-2和Bax mRNA表达的比较
   各组凋亡调控基因Bcl-2和Bax mRNA表达水平的结果显示：与正常对照组比较，糖尿病模型组及中药组Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.05)；与糖尿病模型对照组相比，中药组Bcl-2 mRNA表达水平升高 (P<0.05)。与正常对照组比较，糖尿病模型组Bax mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，中药组Bax mRNA表达水平没有明显变化(P>0.05)；与糖尿病模型对照组相比，中药组Bax mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。
结论：
1 糖尿病胃轻瘫大鼠存在明显的胃排空障碍；益气养阴化痰通络中药可明显降低糖尿病胃轻瘫大鼠血糖，促进胃排空，对糖尿病胃轻瘫有治疗作用。
2 糖尿病胃轻瘫大鼠胃组织氧化应激水平升高，氧化应激介导胃平滑肌细胞凋亡可能是DGP发生、发展的中心环节。
3 益气养阴化痰通络中药可调节机体氧化应激水平，通过上调Bcl-2表达，降低Bax表达，从而抑制氧化应激导致的胃平滑肌细胞凋亡，进而改善胃动力功能，这可能是其治疗DGP的作用机制之一。
关键词：
糖尿病胃轻瘫；胃排空率；益气养阴化痰通络中药；氧化应激；HO-1；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

3.2、糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)
糖尿病肾病是糖尿病慢性微血管并发症之一，是糖尿病致死、致残的重要原因。氧化应激理论被认为可能是糖尿病肾病多条途径的最终通路[23]。HO-1具有抗氧化应激、抗炎等细胞保护作用,它可以产生抗氧化剂胆红素及血管扩张剂CO，对抗ROS造成的氧化损伤、维持血管张力；代偿内皮损伤引起的内皮舒张因子的减少；促进血管内皮细胞的增生，参与内皮细胞活化、增殖和血管形成等。肾髓质是HO的高表达区，HO在肾内呈明显的梯度分布，HO-1则主要在髓质的集合管、亨氏襻及皮质的近端小管、远端小管处存在活性。诱导HO的同工酶表达对DN大鼠模型有保护作用[24]。应用HO-1诱导剂的DM大鼠血清总抗氧化能力与DM组相比明显增高，尿白蛋白排泄率（UEA）有下降趋势，相反，在给予HO-1抑制剂后DM大鼠总抗氧化能力降低、UEA明显增高，这提示提高DM大鼠肾脏HO-1表达水平可以改善肾组织氧化应激状态、延缓肾功能障碍[25]，进而延缓DN进程。临床实验[26]通过研究单纯糖尿病组（DM组）、早期糖尿病肾病组（DMⅠ组）及糖尿病肾病组（DMⅡ组）患者的血红素氧合酶代谢产物与氧化应激指标的变化后发现，各组CO、胆红素以及Fe2+均呈下降趋势，DMⅡ组明显低于DMⅠ组，而随病情进展SOD浓度呈下降趋势，MDA浓度呈逐渐上升趋势。分析这主要是由于高血糖抑制了HO活性和HO蛋白表达，使得内源性HO合成减少。HO的减少不仅使抗氧化作用减弱，而且不能有效发挥的作用抗炎作用。
3.3、糖尿病勃起功能障碍（diabetes mellitus erectile dysfunction，DMED）

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED) 是男性DM患者常见的并发症之一，可导致男性DM患者生活质量的大幅下降[27]。据统计ED在男性DM患者中的发病率为35%~75%，是正常人的3倍[28]。现公认氧化应激是引起糖尿病勃起功能障碍的重要发病机制之一[29]。阴茎海绵体在高血糖刺激下晚期糖基化终末产物增加，ROS明显增多，引起氧化应激反应。随着DM病程的延长，活性氧也愈加增多，而此时抗氧化物的表达及活性下降，抗氧化能力下降，这与糖尿病勃起功能障碍的严重程度有着密切关系[30]。有研究证实，应用抗氧化剂还原型谷胱甘肽[31]可减轻勃起组织氧化应激损害，从而起到改善勃起功能的作用。应激刺激常使得HO-1的表达增加，且对机体常起到保护作用[32]。HO-1主要表达于大鼠阴茎海绵体和血管平滑肌细胞的胞质中[33]。动物实验证实单纯 DM大鼠HO-1代偿能力较强，能对抗氧化应激造成的损害，维持正常的勃起功能；与单纯DM大鼠相比，DMED大鼠HO-1的代偿增加不足[34]，导致胆红素等有抗氧化活性的内源物质生成减少，抗氧化能力下降，且CO生成减少，阴茎海绵体平滑肌结构受损及舒张功能受限，不利于阴茎的正常勃起。
3.4、糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis，DGP）
    1958年Kassander首先提出了糖尿病胃轻瘫的概念，DGP是继发于糖尿病的慢性并发症之一，以胃动力障碍和排空延迟为主要特征。据最近报道，27%-65%的1型糖尿病患者及约30%的2型糖尿病患者中出现胃排空延迟[35]。其主要临床表现为早饱、餐后饱胀、反复呃逆、恶心、呕吐、厌食等症状。
糖尿病时由于高糖毒性的作用，可以累及胃肠的血管、神经，导致胃肠动力的变化。这种高糖毒性发生的主要机制之一是氧化应激。金启辉等[36]研究发现，在胃动力下降的糖尿病大鼠中，其胃平滑肌组织脂质过氧化，氧化应激增加，抗氧化水平下降；给予抗氧化治疗后，胃动力得到明显改善，这说明通过抗氧化治疗可以减轻糖尿病大鼠的胃损伤，恢复胃动力，也说明氧化应激在糖尿病胃动力方面发挥重要作用。
HO-1作为一种应激蛋白，在有害环境刺激和疾病条件下对消化道具有抗炎、抗组织损伤、抗氧化、细胞黏膜保护以及调节胃肠运动等积极作用。李军杰等[37]通过检测反流性食管炎患者及正常对照组的食管黏膜中HO-1蛋白的表达强度，发现反流性食管炎患者HO-1的表达明显强于对照组，且随着食管炎症程度的加重，HO-1蛋白表达一致性增强，发挥了自身保护效应。Choi等[32]在动物研究中建立了糖尿病胃轻瘫模型，发现HO-1可通过保护Cajal间质细胞改善胃动力，增加HO-1的表达可以阻止胃轻瘫的进程。高血糖在DGP发生、发展过程中起着重要作用，虽其发病机制尚未完全明确、病理学特征也有待进一步研究，但通过诱导抗氧化剂HO-1的表达来治疗DGP有望成为新的方向。

参考文献

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3 Funk M，Endler G，Schillinger M，et al. The effect of a promoter polymorphism in the heme oxygenase-1 gene on the risk of ischaemic cerebrovascular events: the influence of other vascular risk factors. Thromb Res，2004，113:217-223
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