大鼠心肌缺血后适应（IPOC）和心肌TOLL样受体4（TLR）

摘 要：目的比较大鼠心肌缺血再灌注及心肌缺血预适应，心肌缺血后适应心肌中Toll样受体4 ( TLR4)的表达变化。  讨论心肌缺血后适应以及Toll like receppt 4(TLR4)对心肌缺血再灌注损伤的影响。 方法将48只Vistar大鼠随机等分为4组，假手术组(shame组):开胸暴露心脏，左冠状动脉前降支仅穿线不结扎；  心肌缺血再灌注组(I/R组):前降支血管先结扎造成心肌缺血30 分钟，后持续灌注60分钟；心肌缺血预适应组（IPC组）：前降支血管先进行5分钟结扎缺血，5分钟再灌注循环3次，然再后结扎前降支血管造成心肌缺血30分钟，后持续灌注60分钟； 心肌缺血后适应组（IPOC组）:前降支血管结扎造成心肌缺血30分钟后，首先进行3次，5分钟/5分钟的短暂的缺血/再灌注循环，然后持续灌注60分钟。造模结束后，处死实验大鼠，摘除大鼠心脏，用0.1%NBT染色，测量大鼠左心室心肌梗死面积；Envision免疫组化法检测各组心肌TLR4的表达水平。  结果(1)与I/R组比较，IPC组、IPOC组大鼠左心室心肌梗死面积减小（P < 0.05）；和IPC组相比，缺血后适应组降低大鼠左心室心肌梗死面积和IPC组无显著性差异（P＞0.05）。 (2)TLR4表达水平:与Shame组比较，其余3组TLR4表达显著增加；  与I/R组比较，IPC组、IPOC组大鼠TLR4表达显著下降（P < 0.05）；  与IPC组比较，IPOC组TLR4表达与IPC组无明显差异（P > 0.05）。  结论IPOC可能保护缺血再灌注损伤，其减小心肌梗死面积与IPC具有同样作用； 抑制TLR4的表达可能是其保护I/R心肌的一个重要途径。

关键词：心肌缺血再灌注损伤,缺血后适应,Toll样受体4
ABSTRACT
Objective Comparison of myocardial ischemia and reperfusion and preconditioning after myocardial adaptation of Toll-like receptor4(TLR4) expression change.   To invest
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igate the roles of ischemic postconditioning and Toll like receptor 4 in myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods A total of 48 Vistar rats were randomly divided into four groups, shame operation group(shame): thoracotomy esposed 30 min, without ligation of anterior descending branch of left coronary artery; myocardial ischemia reperfusion group (IR):ligation of anterior descending branch of left coronary artery for 30 min reperfusion for 60 min. Preconditioning(IPC)group: anterior descending branch of left coronary artery to5min/5min of ischemia/reperfusion cycle three times, after the ligation of anterior descending branch of left coronary artery for 30 min reperfusion for 60 min. ischemic postconditioning(IPOC) group: after ligation of anterior descending branch of left coronary artery after 30 min, immediately given 5 min/5min of ischemia/reperfusion cycle three times, reperfusion for 60 min.
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 The rats were sacrificed at the end of experiment remove the hart, left ventricular infarction area was measured by into blue tetrazolium(NBT) staining, the expression of TLR4 was detected using Envision. Results (1)compared with I/R group, the IPC group the IPOC group rats left ventricular infarction area decreased(P < 0.05); compared with the IPC group, IPOC reduce rats left ventricular infarction ares and IPC group no significant difference(P > 0.05) .(2)The TLR4 expression level: compared with I/R group, the IPCgroup,IOPC group TLR4 expression of rats decreased significantly (P < 0.05);compared with the IPC group,IPOC group of TLR4 expression has no obvious difference(P > 0.05). Conclusion IPOC reduce extent of myocardial I/R and reducing myocardial infarction area and IPC has the same effect, inhibition of the expression of TLR4 might be its protection is an important way of myocardial I/R.
前言
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急性心血管疾病在我国发病率逐年攀升，这不仅使心肌缺血再灌注治疗在临床应用增加（心肌缺血再灌注治疗包括溶栓、经皮穿刺冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术(CABG)等）。 同时也增加了心肌缺血再灌注损伤的发生。这是继急性心肌梗死后，向临床医生提出的新的挑战。  心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，。MIRI）是在心肌缺血的急性心血管事件基础上，重新恢复冠脉血流之后，原缺血心肌组织损伤反而加重,甚至发生不可逆损伤的现象，比如心肌细胞死亡、心脏血流动力学障碍、出现再灌注心律失常和血管内皮功能障碍等[ 1]。在面对心肌缺血再灌注损伤的临床难题上，国内外已经进行了大量的实验研究及探索，并且已经找到了能够减轻这种损伤的方法。研究证明心肌缺血预适应(Ischemic preconditioning, IPC)，心肌缺血后适应(Ischemic postconditioning，IPOC)以及优化TOLL样受体4（Toll-like receptor-4,  TLR4）等方法均可保护心肌组织，减轻MIRI[2-4]。近期 国内外大量研究证明TOLL样受体4参与心肌缺血再灌注损伤，并且通过抑制TLR4受体，干预TLR传导通路，可以对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。如Oyama 等［5］建立小鼠心肌I /R 模型，  研究发现TLR4 缺陷型小鼠因为TLR 4 信号传导的缺失，在小鼠心肌缺血再灌注1小时后，和假手术组比较，可以减小鼠心肌缺血再灌注过程的心肌梗死面积，并且可减轻小鼠心肌缺血再灌注过程与心肌损伤加重有关的炎症反应， 其中包括中性粒细胞聚集、氧化应激、补体活化沉积等。 另有研究表明，可溶性的TLR4抑制剂能够防止野生型大鼠缺血再灌注损伤，减少中性粒细胞浸润、减少活性氧的产生，减少细胞凋亡， 减轻[6]心肌收缩功能障碍，减少心肌梗死面积。目前国内外有研究表明将优化TLR4及其通路与IPC相结合通过药物预处理缺血再灌注心肌，可以达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的。  2011年景桂霞[7]等在SD大鼠心肌缺血再灌注模型研究发现：与假手术组（Shame）组比较，  IR组和七氟醚预处理（sP）组TLR4、核因子（Nuclear factor Kappa,   NF-KB）和肿瘤坏死因子（TNF-a）的蛋白表达上调(P<0．05)；  与IR组比较，sP组TLR4、NF-KB和TNF-a的蛋白表达下调(P<0．05)。  病理学结果显示：SP组心肌细胞损伤较IR组减轻。  提示七氟醚预处理可通过抑制TLR4表达上调，降低炎性反应，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。  由于IPC在临床应用中存在较大风险及医学伦理学问题。  2003年赵[8]等提出了心肌缺血后适应（Ischemic postconditioning，  IPOC）是心肌发生缺血后立刻对冠状动脉进行短暂的、多次的开通及再闭的过程，最后持续恢复冠状动脉血流。心肌缺血后适应也可减少心肌梗死面积，减少细胞凋亡，改善血管内皮功能，缓解缺血心肌水肿，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用[ 9-14 ]。心肌缺血后适应的可操作性预示着其在临床应用中的重要性。 但是对于没有进行冠脉造影条件的患者，及医院，IPOC的治疗仍然存在很大的局限性。这要求我们能够进一步探索，研究新的，方便，有效，适合广泛推广临床的后适应治疗方法。假设目前存在某种药物，可以替代后适应直接对冠脉的开通和再闭，作为接受溶栓，介入等血管再通治疗的补救治疗， 那将大幅度提高缺血再灌注损伤的临床治疗价值。  本文就此设想，将进一步研究IPOC在心肌缺血再灌注损伤中的作用，研究心肌缺血再灌注损伤(I/R)，心肌缺血预适应(IPC)，  心肌缺血后适应(IPOC)中TLR4的表达。  探讨IPOC与TLR4在心肌缺血再灌注损伤发挥其保护作用过程中的相关性，设想其是否存在保护缺血心肌中存在相同或相近的机制，提出是否可能将IPOC与优化TLR4相结合，通过药物后适应治疗心肌缺血再灌注损伤。  为实验室寻找缺血再灌注损伤治疗方法上提供新的研究方向。
1材料和方法
1.1实验动物
Vistar大鼠50只，雌雄不拘，体重180g-250g。购自内蒙古大学动物实
基地提供。
1.2主要试剂
氯化硝基四氮唑兰（Nitro Blue Tetrazolium Chloride, NBT）由美国Amresco公司生产。TLR-4抗体免疫组化试剂盒，购自上海生工公司。
1.3主要器材：
数字式心电图机型号：ECG-8110A，深圳市奥生科技有限公司。  动物呼吸机，型号 HX-300S，成都泰盟科技有限公司生产。电子称，美国梅特勒-托利多生产,电热恒温水浴锅，型号DZKW-D-1，北京市永明医疗仪器厂生产。  Olympus体式显微镜，日本奥林巴斯公司生产。
大鼠各组缺血再灌注模型参照文献[15]方法复制和改良。  大鼠称重后，用3%戊巴比妥钠注射液，按照50mg/kg的比例，对实验大鼠进行腹腔注射麻醉。麻醉满意后，将大鼠仰卧置于解剖台上固定，连接心电图机，记录Ⅱ导联心电图。 颈部、胸部消毒，剪毛；  剪开颈部皮肤，暴露气管钝性分离周围组织，并行气管插管，连接动物呼吸机(潮气量1-3ml/100g，呼吸频率60次／min，呼：吸2:1)；  大鼠开胸，充分裸露心脏，剥离心包膜，依据解剖学理论，在心脏左心耳以下、肺动脉圆锥左侧部位确定左冠状动脉位置，后穿刺，在左冠状动脉前降支根部下1/3处，用3.0无损伤缝合线穿线，并结扎冠状动脉前降支，在结扎线两端分别留置1根结扎松解线图1. 系紧结扎线造成大鼠心肌缺血，牵拉两端松解线使结扎线松开行再灌注。 记录Ⅱ导电图，观察心电图结扎后ST段抬高，提示大鼠心肌缺血，放松结扎线后ST段下降，提示大鼠心肌血流再灌注。为模型成功，各组模型心电图为图3。
48只大鼠随机分为4组，每组12只。假手术（Sham）组： 开胸后暴露心脏，只穿线不结扎。缺血再灌注（I/R）组：前降支血管先结扎造成心肌缺血30 分钟，后持续灌注60分钟缺血预适应（IPC）组：心肌缺血预适应组（IPC组）：前降支血管先进行5分钟结扎缺血，5分钟再灌注循环3次，然再后结扎前降支血管造成心肌缺血30分钟，后持续灌注60分钟缺血后适应（IPOC）组：心肌缺血后适应组（IPOC组）:前降支血管结扎造成心肌缺血30分钟后，首先进行3次，5分钟/5分钟的短暂的缺血/再灌注循环，然后持续灌注60分钟。
造模结束后：处死大鼠，摘取大鼠心脏，生理盐水反复冲洗，每组随机分配：6只采用氯化
硝基四氮唑兰（NBT）染色测量大鼠左心室心肌梗死面积；6只讯速用液氮冷冻后，转入-80℃冰箱进行保存，用于检测心肌TLR4。
摘取大鼠心脏，生理盐水反复冲洗，去除表面脂肪，血管等，并切除左、右心房以及右心室，只留下左心室，并称量左心室心肌重量。 然后将左心室肌切成0.1cm的薄片,浸放在0.1%氯化硝基四氮唑兰（NBT）溶液中,37℃温孵10min进行染色。染色结果：正常心肌染被成紫蓝色,梗死心肌不染色。染色完成后， 剔除已染色心肌，将未被染色的梗死心肌称重。用未被染色的梗死区心肌重量除以大鼠左心室重量,得出结果为梗死区占左心室重的百分比。将石蜡包埋后的心肌标本进行制片前常规处理后，连续切片（厚度约5μｍ）5张，进行Envision染色，标本脱蜡水化后用磷酸盐缓冲液（PBS,   PH=7.4）清洗3次，每次3min（3×3 ‘）。将切片放入EDTA抗原修复液中，同容器放入高压锅中加热至沸腾，持续2min，待修复液恢复室温后，PBS冲洗（3×3 ‘）。  每一张切片滴加一滴或者50µl 3%H2O2 ，在常温下孵育10min，用来阻断内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗（3×3 ‘）。  后兔血清封闭在室温下孵育5min以封闭非特异性的背景染色， PBS冲洗（3×3 ‘）。  甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50µl 一抗TLR-4抗体（1:800），室温下孵育2-3小时。 PBS冲洗（3×3 ‘）。  甩取PBS液，每一张切片滴加一滴或50µl酶标二抗生物素化兔抗山羊IgG,常温下孵育30min。PBS冲洗（3×3 ‘）。  甩去PBS液，每张切片滴加2滴100µl 的DAB显色，苏木素轻度复染，乙醇脱水、透明、中性胶封片。 切片染色后， 光镜下观察3-10min，红色或棕色显色为阳性。每一张切片随机选择3个不重叠的视野，每只标本共计15个视野。 采用Imagepro-Plus6．0图像分析系统，来检测每只心肌标本中TLR4阳性细胞的积分光密度(Integral Optical Density， IOD)值， IOD用来表达组织切片中对应阳的性物质即TLR4表达的程度如表2

本实验通过对48只Vistar大鼠进行心肌缺血再灌注损伤研究，结果发现缺血预适应与后适应均可以减少缺血再灌注损伤心肌梗死面积，  两组之间减少心肌梗死面积程度无明显差异。  缺血预适应与后适应中TLR4表达比缺血组减少，两组之间TLR4表达无明显差异。 说明缺血预适应与缺血后适应可保护缺血再灌注损伤心肌。 结合以往的研究结果，缺血后适应与TLR4在缺血再灌注损伤中可能存在相关性。  将来的研究中是否可能将缺血后适应与抑制TLR或干预TLR通路结合，找出两种治疗缺血再灌注损伤路径的契合点，研究出适合临床推广的药物后适应治疗途径。