芒果苷对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM) 是由于糖尿病状态下糖、脂代谢紊乱导致心肌、血管内皮等组织的代谢紊乱，引起心肌肥大、变性、增厚、间质纤维化，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。近年来越来越多的学者发现，心肌间质纤维化在DCM的发生和发展中起着不容忽视的作用。因此，如何预防和治疗糖尿病心肌纤维化已成为目前国际上研究的热点之一。
AP-1是一种致纤维化因子，在心脏疾病中的作用已逐渐受到人们的关注。它是由原癌基因jun和fos分别编码的JUN和FOS蛋白嵌合而成的二聚体复合物，能结合于DNA上诱导细胞增殖或细胞凋亡[2]。它参与了许多生长因子和细胞因子的基因转录调控，导致机体一系列的生理和病理变化[3]。AP-1也是MAPK信号通路的主要作用底物，MAPK家族中的ERKs、JNKs和p38MAPKs通过不同的底物磷酸化，在基因水平和蛋白水平对AP-1活性进行调控[4-5]。活化的AP-1能与DNA调节序列相结合，可被基因启动子或增强子序列识别并结合，从而启动相应的基因转录。与AP-1结合的DNA序列包括TGF-β1、纤维连接蛋白、层粘连蛋白B及纤溶酶原激活抑制物（PAI-1）等基因的启动子，这些基因的表达均受AP-1调控[6-8]。Aragno[9]等研究发现，高血糖可导致AGEs增加，AGEs和AGE受体结合后诱发氧化应激反应，产生大量氧自由基，激活AP-1,进而上调TGF-βl。
转化生长因子（transforming growing factor-β1， TGF-βl）属TGF-β超家族，是一种多功能细胞信号分子，调控多种靶基因的转录与表达，在细胞增殖、分化及细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）分泌等方面有重要调节作用。TGF-β能在心肌细胞表达，并与心肌纤维化有关[10]。高血糖可通过激活蛋白激酶C（PKC）途径直接刺激TGF-β的表达，进而促进成纤维细胞增生、肥大及胶原合成增加。TGF -β在糖尿病心肌病中，由活化型的TGF-β受体介导，并能在ECM和基底膜处与蛋白质结合而发挥局部生物学作用，其主要作用使成纤维细胞合成胶原纤维、纤维连接蛋白、蛋白多糖增加，促使组织纤维化[11]。
纤维连接蛋白（FN）又称纤连蛋白，分子量440KD。它主要由肝细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、纤维母细胞合成、分泌，能趋化纤维母细胞、内皮细胞、上皮细胞参与组织增生、修复、纤维化。纤维连接蛋白（FN）基因启动子亦有AP-1结合位点[12],AP-1的活化可直接促进FN的表达。
芒果苷(mangiferin)，又名芒果素，知母宁，是从百合科植物知母中提取的天然多酚类化合物。众多研究表明，芒果苷具有抗氧化[13]、抗病毒、调节凋亡、抗肿瘤、抗糖尿病[14]、抗炎症等作用。Girón等研究也表明：芒果苷可抑制α-糖苷酶活性，使葡萄糖在肌肉和脂肪细胞中的转换增加更多的进入组织，降低血糖[15]，同时对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用良好，使得葡萄糖基无法水解进入血液成为游离葡萄糖。本实验建立糖尿病大鼠模型，观察芒果苷对糖尿病大鼠心脏的保护作用以及对AP-1、 TGF-β1、FN表达的影响，进而探究芒果苷治疗糖尿病心肌病的机制，为临床干预糖尿病心肌病提供新的依据。
糖尿病心肌病(DCM)是指糖尿病时心脏微血管病变和心肌代谢紊乱引起的心肌广泛灶性坏死，可诱发心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死。临床早期主要表现为舒张功能不全，晚期也合并收缩功能障碍。
1.糖尿病心肌病大鼠模型
链脲佐菌素（streptozocin, STZ）是一种从链霉菌属中提取的抗生素，能选择性地作用于胰岛的β细胞，诱导糖尿病的发生[16]。STZ腹腔或尾静脉注射是制备糖尿病大鼠模型的常用方法。本实验尾静脉注射1% STZ 45mg/Κg,72 h后，连续三次随机血糖≥16.7mmol/L为DM模型。饲养12W后，糖尿病模型组大鼠心脏质量指数及左心室质量指数均明显升高；LVEDP明显升高，LVSP、±dp/dtmax显著降低，提示模型组大鼠心功能已明显受损。从形态学上看，HE染色：DM模型组大鼠心肌细胞体积明显增大，大小不均，胞浆丰富，心肌纤维排列紊乱，出现炎性细胞浸润。Masson染色心肌间隙明显增宽，胶原纤维明显增多。
2. AP-1/TGF-β1/FN信号通路与糖尿病心肌病
活化蛋白- 1（activator protein-1, AP-1）被誉为细胞内信号转导的第三信使，启动基因转录的分子开关，其在细胞增殖、分化、凋亡等病理过程中起着枢纽作用。它不仅参与了许多细胞因子的转录、诱导粘附分子的表达和自身免疫应答，还能够激活基因诱导的自身免疫介导的胰岛 β 细胞凋亡[17]。因而 AP-1 介导的转录异常有可能导致 1 型糖尿病的发生[18]。Jun 和 Fos 基因对一系列刺激极为敏感[19]，这些刺激包括[20]：TPA、血清、细胞因子及 T、B 淋巴细胞激活蛋白、神经递质和紫外线照射、电离辐射、DNA 损伤、氧化应激等，受刺激后迅速被活化，Jun 和 Fos蛋白的表达显著增加。糖尿病时糖代谢紊乱，大量的ROS产生。活化的ROS可激活PKC和MAPK，进而使转录因子AP-1发生磷酸化后而被激活[21]。
活化的AP-1能与TGF-β1结合，促进TGF-β1的表达，进而使心肌纤维化。研究发现，TGF-β1的基 因启动子中含有两个AP-1的结合位点（位于-453至-323之间），其中任何一个突变或应用A P -1特异性抑制剂姜黄素均能阻断高糖诱导的TGF-β1的表达。这提示TGF-β1基因转录为AP-1依赖性的[22]。Weigert等[23]发现，低分子肝素可抑制TGF-β1上的AP-1结合位点，从而阻断了高糖诱导的TGF-β1的表达。
TGF-β1是一种强效致纤维化因子，其表达升高与多种原因引起的纤维化密切相关，是纤维化形成最重要的作用因子之一。研究[24]发现TGF-β1是 DC 发展过程中重要的致病因子，能够促使心肌细胞肥大，促进细胞外基质的合成增加，进而对心肌组织产生损害。另外，活化的 TGF-β1 可抑制蛋白水解酶和间质金属蛋白酶-2 的表达，抑制纤溶酶原、胶原酶、基质酶酶原激活物的产生，诱导蛋白水解酶抑制物的合成，从而使 ECM 降解，最终使 ECM 在细胞间沉积[25]。刘晓健等[26] 研究发现糖尿病大鼠心肌组织 TGF-β1 的表达明显增强、心肌纤维间微血管基底膜显著增厚且突向管腔，血管基底膜增厚导致血管功能紊乱，说明 TGF-β1 的强表达参与了糖尿病心肌病变的发生与发展。TGTokudome 等［27］将心肌成纤维细胞置于高糖溶液中培养，结果发现高糖能增TGF-β1 mRNA表达，加速胶原合成，并且胶原增加程度与TGF-β1 mRNA 水平增加一致。高糖[28]可通过 TGF-β1 介导使 FN mRNA 表达上调，FN 表达明显升高。
纤维连接蛋白（FN）是一类具有多种生物学功能的大分子糖蛋白，广泛存在于细胞表面、结缔组织基质及体液中。FN 是细胞外基质的主要成分之一，它 是最早出现在损伤组织中的基质蛋白成分，常被用作评价基质积聚程度的指标。FN 是构成间质的主要糖蛋白,存在于心肌 ECM 中，就像心肌细胞与基质胶原之间的一座桥梁[29]。在病理过程中它可以促使成纤维细胞增生并产生更多的 ECM，而增多的 FN 又在各种生长因子的作用下，引起细胞肥大和纤维细胞增生，这个过程持续发展，ECM 不成比例的过度积聚，胶原含量增加，最终导致纤维化。本实验中，与正常对照组相比，糖尿病模型组AP-1、TGF-β1、FN的表达增加显著，这与国内外相关研究一致，同时提示AP-1/TGF-β1/FN信号通路可能参与了糖尿病心肌损伤。
三、芒果苷对糖尿病心肌的保护作用
芒果苷是一种强氧化剂，不但可以清除氧自由基，还可抑制氧自由基的生成[30]。芒果昔能够阻止十四酰佛波醇醋酸盐醋(TPA)即所引发的大鼠肝脏、大脑氧化损伤及腹膜巨噬细胞活性氧（ROS）的产生,还能减少TPA诱发诱发的DNA 片段的形成。研究表明，芒果苷对H2 O2 引起的小鼠红细胞的氧化损伤有保护作用，可以抑制红细胞氧化溶血和膜蛋白降级，进而保护由于H2 O2引起的红细胞膜的改变[31]。Muruganandan等[32]采用环磷酰胺诱导成年雄性大鼠免疫毒性，发现芒果苷能明显降低细胞免疫应答反应及靶器官的重量，可增强淋巴细胞、多形核细胞、巨噬细胞中脂质过氧化作用，降低过氧化氢酶和血清肌酸磷酸激酶的活性， 进而改善环磷酰胺导致的组织损伤。Prabhu[33]研究芒果苷能使心脏组织抗氧化酶如SOD，过氧化氢酶，谷胱甘肽还原酶的活性和非酶抗氧化剂等的活性显着上升，提高对抗心肌防御系统损伤的敏感性。
本研究显示，与糖尿病模型组相比，芒果苷各剂量组大鼠心脏质量指数及左心室质量指数、LVEDP均降低，LVSP、±dp/dtmax升高，心肌病理改变均减轻，且以芒果苷高剂量组改善最为显著，说明芒果苷对糖尿病心肌具有保护作用；与；糖尿病模型组相比，芒果苷各剂量组AP-1、TGF-β1、FN的表达均降低，且呈剂量依赖性，提示芒果苷可能通过抑制AP-1/TGF-β1/FN信号通路，进而改善糖尿病心肌病损。
综上所述，芒果苷对糖尿病心肌组织具有保护作用，其机制可能为抑制AP-1的表达，进而下调TGF-β1、FN，减少胶原纤维沉积，但具体机制有待进一步的探究。
糖尿病心肌病的研究新进展

1972年，Ruber等人根据4个成年糖尿病患者在无明显的冠状动脉及瓣膜病变、先天性心脏病、高血压及酗酒的情况下患充血性心衰（CHF）首次提出糖尿病心肌的概念[1]。糖尿病心肌病变是由糖尿病状态所导致的一种心脏疾病，与血管及瓣膜病理改变无关，早期表现为无症状的舒张功能障碍，最终将发展为有症状的充血性心衰，心室顺应性下降，收缩功能受损[2]。糖尿病使发生充血性心衰的危险性增加2.5~5.0倍，除了糖尿病常伴有的CHF传统的危险因素如肥胖、高血压、冠脉病变外，糖尿病心肌病变发挥了重要作用[3]。
1.　DCM的发病机制
1.1 心肌细胞的代谢障碍 　
糖尿病患者糖代谢异常和脂代谢异常是加速心肌病变发生发展的重要原因。Golfman等[4]报道Zucker糖尿病肥胖大鼠心肌细胞中三酰甘油（TG）积聚，过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR-α）调节基因转录水平增加，GLUT-4转录下调，而使用PPAR-α激动剂可以逆转上述改变。这表明心肌细胞代谢紊乱，脂毒性均参与了糖尿病心肌能量代谢和心功能的改变。糖尿病慢性并发症主要由体内四种代谢途径异常所致，即多元醇代谢亢进，蛋白激酶C（PKC）激活，蛋白质非酶糖化及起其终产物（AGEs）形成增加，己糖胺途径活性增高。长期高血糖能促进体内蛋白质非酶糖化形成AGEs，心肌中较多糖蛋白和ACEs沉积，导致心肌收缩功能和顺应性下降，影响和损害组织或器官功能。此外，AGEs还能影响内皮细胞一 氧化氮（NO）的合成，使冠状血管的舒张功能受损。高血糖可激活PKC，PKC是参加促使正常心肌转化为DCM的重要途径之一，有学者认为，其亚型PKC-β还与糖尿病微血管病变或大血管病变的病理改变有关[5]。目前认为糖代谢异常是DCM发生的关键始动因素。
1.2 心肌离子通道异常和电生理改变
心肌细胞内的Ca是调节心肌收缩的重要离子。糖尿病心肌毒性物质的聚集会引起心肌亚细胞水平重构和钙的超负荷，其机制包括内质网Ca-三磷酸苷酶活性下降，心肌肌浆网Ca-ATP酶摄取Ca能力下降以及Na-Ca交换和肌浆Ca
泵能力减低[6]。糖尿病心肌肌钙蛋白I磷酸化导致心肌Ca对心肌调节蛋白系统敏感性下降。Belke等研究发现糖尿病大鼠心脏中内质网Ca-三磷酸苷酶和钙泵蛋白减少是导致左室收缩功能不全的原因。
细胞膜上参与动作电位复极的钾外流降低和钙通道水平上升是直接导致心肌细胞动作电位周期延长及胞内钙超载的主要因素。Qin等[7]用RNA酶保护分析法和Western印迹研究糖尿病大鼠左心室心肌K通.道基因表达和分布密度，发现糖尿病大鼠在发病早期就存在K通道Kv2.1,Kv4.2和Kv4.3明显减少,K内流抑制,由此引起动作电位时程延长,复极滞缓等心肌电生理异常,从而导致恶性心率失常和猝死的发生.。
1.3 氧化应激的作用
氧化应激主要是由心肌抗氧化能力受损及活性氧族过度产生的两个机制构成:：（1）相关实验证明[8]，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心脏中抗氧化和抗凋亡蛋白下调，谷胱甘肽、尿酸氧化物的利用度下降，导致心脏抗氧化防御能力降低。（2）生理情况下，活性氧族主要由线粒体产生，而在糖尿病时活性氧族可通过脂质代谢、葡萄糖自身氧化等多种途径产生。烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性降低和黄嘌呤氧化还原酶活性增加均可促进活性氧族产生。活性氧族可影响多种线粒体蛋白的活性，使ATP生成减少而发生细胞功能障碍，降低细胞中还原性谷胱甘肽水平及还原性谷胱甘肽水平/氧化型谷胱甘肽比例，从而损害细胞膜的完整性，增加细胞膜的通透性，使血管基底膜增厚，导致微血管病变。氧化应激损心脏后可通过激活核糖聚合酶来修复损伤[9]。而核糖聚合酶的过度激活和细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸氧化态进一步消耗，导致氧化还原失衡，细胞内氧化状态更加恶化。
1.4心肌细胞凋亡
心肌细胞有不可再生的特点，在糖尿病心肌病变过程中有心肌细胞凋亡的发生，并随心脏功能的降低呈加速趋势。长期心肌收缩单位的丧失将会加速心衰的形成，因此心肌细胞凋亡可能是导致糖尿病心肌细胞丢失及心力衰竭的重要原因之一。
有报道链脲佐菌素（STZ）诱导的 糖尿病大鼠合并心肌梗死1周后，心肌凋亡程度较非糖尿病组明显增加，6周的生存率明显低于非糖尿病组，心肌细胞凋亡增加，心梗后左室重塑和心衰恶化，而高血糖是影响心梗后STZ糖尿病大鼠存活率的重要因素[10]。使用不同血糖浓度培养心肌细胞发现，细胞凋亡程度与血糖浓度成正相关，高血糖通过活性氧簇线粒体途径导致心肌细胞凋亡[11]。有研究指出，糖尿病线粒体谷胱甘肽衰竭是启动细胞凋亡程序的重要因素，STZ糖尿病鼠中活性氧簇增加和谷胱甘肽耗竭与糖尿病心肌细胞凋亡存在显著相关性[12]。