益气养阴方对肺间质纤维化大鼠模型TNFaTGFβ1I

清洁级健康雄性SD大白鼠60只,体重为(240±10)g,纯白色,由湖北省动物实验中心提供,合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。
实验前7天将购入的60只健康雄性SD大鼠适应性喂养于实验环境中,室温保持在20℃一25℃。然后将其随机分为正常组、模型组、中药组、激素组、中药+激素组5组,每组各12只。
手术前一天,对大鼠颈部行脱毛及备皮处理。手术开始后,首先将大鼠用配制好的3.5%水合氯醛(lOml/kg)麻醉后仰卧固定于35度倾斜手术板上,使大鼠咽喉部皮肤暴露在光源下,切开颈部皮肤,用血管钳钝性分离出气管,用1ml注射器在环状软骨间刺入气管腔,回抽,有气体则缓慢注入BLMA5(5mg/kg),注射完毕后迅速将手术板竖立并旋转,使药物尽可能均匀分布在大鼠肺内,然后逐层缝合肌层及皮肤,消毒。术毕,予以注射青霉素(8万u/天,持续注射3天)预防感染,待动物清醒后自由进食。另外正常组大鼠,气管内注入的为等体积生理盐水,其它操作同上述造模法。
造模后第28天,开始灌胃给药,连续给药28天,给药剂量由成人每日常规服药量换算而成。
①正常组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；
②模型组：生理盐水2ml,灌胃,每日一次；
③中药组：配制好的中药予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；
④激素组：将配制好的浓度为35%的醋酸泼尼松溶液予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；
⑤中药+激素组：将配制好的中药+激素混合溶液予以1ml/100g体重,灌胃,每日一次；
以上各组大鼠均置于相同实验环境下饲养,室温保持在20℃一25℃,自由进食,饮水,于灌胃后第14、28天分批处死。
配制好的3.5%水合氯醛溶液(现配)腹腔注射麻醉大鼠,断头处死,固定在手术板上,暴露胸腔,切开皮肤,逐层分离肌层,剪断肋骨,完整分离出肺组织。取左肺下叶一部分组织浸泡在准备好的10%中性甲醛溶液中,常规脱水、浸蜡、包埋,切片后进行HE染色及Masson染色观察肺组织形态学改变。同时取右肺底一部分组织置入DEPC水处理后的4%多聚甲醛溶液中及时固定,常规脱水、浸蜡、包埋,切片后行原位杂交法检测肺组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达。
观察并记录各组大鼠饮食、饮水、皮毛、精神状况、二便、体重以及死亡情况等。

(1)肺组织形态学观察
1)肉眼观察各组大鼠肺组织外观形态
断头处死大鼠后,肉眼观察分离出的完整肺组织外观形态。
2)肺病理组织学观察
将固定好的大鼠左肺下叶行HE染色及Masson染色观察肺组织形态学改变。
HE染色法：
①取材,不能太大太厚,最好为24×24×2mm；
②包埋；
③切片,厚度5～10um间,厚薄均匀,无皱褶无刀痕；
④石蜡切片经常规脱蜡至水；
⑤水洗；
⑥染苏木素3－5分钟；
⑦分化；
⑧于碱水中返蓝20秒左右；
⑨伊红染色10－20秒；
⑩脱水,透明,中性树胶封固,镜检。
Masson染色法：
①石蜡切片脱腊；
②梯度入水：95%、70%、30%乙醇各漂洗2分钟,蒸馏水2分钟；
③温热水漂洗：于30-40℃温热水中漂洗,每次30-60秒,一共2次；
④于蒸馏水润湿玻片30-60秒；
⑤R1核染液染色1分钟左右,倒丢,冲洗液冲洗30秒左右；
⑥R2浆染液染色1分钟秒左右,倒丢,冲洗液冲洗30秒左右；(R2染色时间不宜太长否则可导致胞浆着色过深,使R3褪色效果不佳)
⑦R3黄色分色液分色6-8分钟左右(于镜下观察标本中胶原纤维部分褪色成淡粉红色为宜。如果褪色效果不佳,可适当调整分色时间,以便让胶原纤维更易着色)。弃去分色液。(无需冲洗)
⑧用R4蓝色复染液复染5分钟左右,倒丢,然后用无水乙醇冲洗。
⑨吹干,封片,镜检。
(2)原位杂交法检测肺组织中TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达
将固定在配制而成的固定液{4%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.0-7.6),含有1/1000DEPC}中的右肺组织固定完毕后按下述步骤进行处理：
①常规脱水、浸蜡、包埋。冰冻后切片,切片厚度6-8μm；
②玻片的处理：玻片(包括盖玻片和载玻片)应用热肥皂水冲洗,再用蒸馏水冲洗,洗净后,置于清洁液中浸泡24h,然后蒸馏水洗净烘干,用95%酒精浸泡24h后蒸馏水冲洗,用烘箱烘干(温度最好在150℃及以上,过夜以便除去RNA酶)；
③石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤3次；
④暴露mRNA核酸片段：在切片上滴加配制好的3%柠檬酸新鲜稀释后的胃蛋白酶(由1ml3%柠檬酸和2滴浓缩型胃蛋白酶混匀而成),在37℃或室温下消化30分钟左右。原位杂交用PBS洗涤3次×5分钟。然后蒸馏水洗1次；
⑤后固定：此为关键步骤,待胃蛋白酶消化好后再用配制而成的固定液{1%多聚甲醛/0.1MPBS(PH7.2-7.6),含有1/1000DEPC}在室温下固定10分钟,蒸馏水冲洗3次。
⑥预杂交：将准备的湿盒洗净后晾干,然后向其底部加20%甘油以保持湿盒湿度,每张切片滴加20ul预杂交液,放入37℃恒温箱4小时,吸取多余液体,不洗；
⑦杂交：每张切片滴加20μl杂交液,并盖上原位杂交专用盖玻片,然后连同湿盒放入42℃恒温箱内过夜；
⑧杂交后洗涤：从恒温箱取出湿盒,揭掉切片上的盖玻片,37℃水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次；37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次；
⑨滴加封闭液：滴加后放入37℃恒温箱30分钟,甩去多余液体,不洗；
⑩滴加生物素化鼠抗地高辛：滴加后放入37℃恒温箱1小时。用DEPC水处理过的原位杂交用PBS洗涤5分钟×3次；
滴加SABC：滴加后放入37℃恒温箱20分钟。原位杂交用PBS洗涤5分钟×3次；
滴加生物素化过氧化物酶：滴加后放入37℃恒温箱20分钟。原位杂交用PBS洗涤5分钟×4次；
二氨基联苯胺(DAB)显色：DAB显色试剂盒-取用1ml蒸馏水,往里加入显色剂Ａ,Ｂ,C各一滴,混匀后滴加在切片上,室温显色10分钟,充分水洗；
○14酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。镜检。
在高清晰光镜下行阳性细胞率检测[36]:在每个切片上随机取5个视野,镜下观察,胞质中有棕黄色颗粒即为阳性,计算出阳性着色面积,然后利用单位面积内的总细胞数通过计算得出其中的阳性细胞数,再将5个视野平均,可以求出切片中阳性细胞比例,最后用阳性细胞的百分率%来表示TNF-a、TGF-β1、IFN-r的表达。
实验数据中计数资料用χ2检验；计量资料则用X土s表示,采用F检验及SNK检验,应用SPSS19.0统计软件来进行数据处理,若P<0.05,则可以认为存在显著性差异,具有统计学意义。造模后各组大鼠均在3小时内清醒,分别放回各鼠笼内,开始正常饮食,饮水。术后一周后检查所有造模大鼠手术切口,均愈合良好。给药前第0d即造模后第28d,正常组发育正常,体重增加明显；其他4组(造模组)食欲不振,体重增长低于正常组。给药后正常组饮食如常,好动活泼,反应敏捷,皮毛有光泽,体重逐渐增加,二便正常,第28天时无死亡现象；模型组食欲不振,精神萎靡,反应迟钝,蜷缩少动,多有皮毛倒竖现旬,身体较其它组消瘦,且均有不同程度的咳嗽,二便减少,28天时死亡4只；中药组饮食可,反应灵敏,体重无明显减轻,二便正常,28天时无死亡现象；激素组及中药+激素组饮食、皮毛尚可,体重有所减轻,28天时各有2只死亡。由表1可知,给药前第0d即造模后第28天,模型组、中药组、激素组及中药+激素组与正常组相比,体重明显降低,且有明显差异(P<0.05)；给药后第14天正常组体重均高于模型组、中药组、激素组及中药+激素组,但无明显差异(P>0.05)；给药后第28d中药组与激素组体重增长高于模型组,且有显著性差异(P<0.05)；中药+激素组体重略高于模型组,但无显著性差异(P>0.05)。
通过比较表2数据,可发现模型组在给药28天后的存活率为66.67%,明显低于正常组与中药组大鼠的存活率,且具有显著性差异(P<0.05)；激素组及中药+激素组存活率略高于模型组,但无显著性差异(P>0.05)。

肺指数即肺脏总湿质量与实验后体质量之比[37],它可以衡量肺组织纤维化的程度。从公式可以看出,肺指数的大小与肺脏总湿质量成正比,所以各种原因导致的肺脏总湿质量增加均可使肺指数升高。
由表3可知,激素组、中药组及中药+激素组肺指数相比于模型组均下降,且具有显著性差异(P<0.05)；模型组大鼠与正常组相比肺指数升高,且有显著性差异(P<0.05)；中药组肺指数略低于激素组及中药+激素组,且有显著性差异(P<0.05)。4.2.1肉眼观察各组大鼠肺组织外观形态（给药后第28天）正常组大鼠肺组织未见明显病变,表面光滑,粉红色,质地均匀,弹性好,切面均匀,无实变表现,无囊腔；模型组大鼠肺组织表面凹凸不平,肺组织弹性减弱,局部可见散在出血点,部分区域呈苍白色,切面呈弥漫性实变,并可见多个大小不等的囊腔；激素组大鼠肺组织表面有少许凹凸不平,但程度较模型组轻,表面光滑,仍呈暗红色,弹性良好；中药组大鼠肺组织与正常组大鼠肺组织相近,颜色呈暗红色,质地均匀,弹性良好,切面均匀,无实变表现；中药+激素组与激素组肉眼看起来无明显差别。（附图1）4.2.2光镜下观察各组大鼠肺组织形态（HE染色与Masson染色）给药后第28天后处死大鼠,光镜下可发现正常组肺组织结构正常,肺泡结构完整,肺泡间隔无水肿,无炎性细胞浸润,毛细血管充盈；模型组大鼠肺组织肺组织结构紊乱,肺泡部分消失,肺泡壁显著增厚,肺泡腔及肺间质大量炎细胞浸润,伴有大量胶原沉积,毛细血管腔闭塞；激素组、中药组、中药+激素组肺泡破坏程度、肺泡间隔厚度及炎细胞浸润程度与模型组相比均有不同程度的减轻,其中以中药组与中药+激素组最明显。（附图2）4.2.3肺组织中TNF-amRNA、TGF-β1mRNA、IFN-rmRNA的表达（原位杂交法）光镜下观察,根据着色程度分级,无着色代表(-),棕黄色代表(+),深棕黄色代表(++),棕褐色代表(+++),(+)以上确定为阳性。博来霉素（BLM）是一种多肽类抗肿瘤药物,其主要副作用之一是可以导致肺纤维化。Thrall[35]等通过研究发现向大鼠气管内注入小剂量BLM可导致大鼠肺间质纤维化,并且还发现这种病理过程与人类IPF的病理过程相类似,从此气管内灌注博来霉素建立肺间质纤维化模型逐渐成为了经典的造模方法。柴文戍[38]等采用经典造模方式造模后通过光镜、电镜观察发现造模1-7d后肺部即有损伤,但多以肺泡炎为主,14d以后开始发展为慢性纤维化,28d后慢性纤维化明显。金晓光等[39]将60只雄性SD大鼠随机分为正常组（10只）及不同时间点的5组模型组（各10只）,模型组造模成功后分别于不同时间处死,相关指标测定后发现,14d、28d、56d大鼠肺纤维化程度明显高于正常组及3d、7d模型组。本实验造模复制了经典的BLM致大鼠肺纤维化模型,肺组织病理可发现模型组大鼠肺纤维结缔组织明显增生,成纤维细胞明显增多,肺组织破坏呈进行性发展,肺泡结构破坏,以肺纤维化改变为主。原位杂交试验发现肺组织内TNF-a和TGF-β1表达水平明显升高,与文献结果相符[40],模型复制成功。由于目前并没有出现广泛应用于治疗IPF的中成药,所以本实验选取了西医上治疗IPF首选的药物作为阳性对照药。大量研究表明糖皮质激素有抑制肺纤维化的作用。醋酸泼尼松片是糖皮质激素中最基本和最常用的药物之一,故本实验的阳性对照药选用了醋酸泼尼松片。IPF的发病机制目前尚不清楚,可能与自身免疫、环境暴露、胃食管返流、病毒感染和吸烟等因素有关。随着对IPF发病机制的深入研究,人们将注意力逐渐从关键部位细胞成分的变化转移到细胞因子与相关调控失衡机制上,并在该机制的研究上取得了一定进展,初步提出了“细胞因子假说”[41]。该假说认为：当肺组织受到致病因素损伤后,使细胞因子中的促纤维化因子与抗纤维化因子之间的平衡失调,使各种炎症细胞增多并被激活,这些炎症细胞能促进肺纤维化过程,最终形成肺纤维化。5.3.1促纤维化因子促纤维化因子指某些能促进肺组织内成纤维细胞分裂增殖并促进胶原合成的细胞因子。现阶段被证实与肺纤维化有关的细胞因子有20余种[42],特别是TNF-a和TGF-β1。Coker[43]等研究发现TNF-a和TGF-β1不仅能刺激成纤维细胞分裂增殖或产生胶原,而且能使IPF患者的肺内基因表达及蛋白产量升高,研究还发现应用TNF-a及TGF-β1的抑制剂可以减轻肺间质纤维化动物模型的纤维化程度。（1）肿瘤坏死因（TNF-a）TNF-a在肺间质纤维化的进展中十分重要,它可以通过上调单核细胞趋化蛋白(MCP-1)和细胞粘附分子(CAM-1)等途径,促使炎症细胞吸附,还可以参与调节其他细胞因子,使成纤维细胞增殖,促进炎症反应以及胶原蛋白的沉积[44]。TNF-α分泌增加能改变胶原蛋白、纤维结合素以及其他细胞因子等相关纤维形成因子的转录机制,激活炎症级联效应,促进炎症的发展[45]。（2）转化生长因子（TGF-β1）研究表明,TGF-β1在肺纤维化进程中是重要的促纤维化因子[46],它可以促进纤维细胞激活向肌成纤维细胞转化,直接导致纤维化。TGF-β1在细胞因子与相关调控失衡机制上占据主导地位,它对单核巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等具有趋化作用,并能促进其它细胞因子如：血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF-α等的表达。TGF-β1促进血小板释放出PDGF后,再通过PDGF促进肺成纤维细胞的增殖及纤维组织的增生。另外TGF-β1在肺泡巨噬细胞以及肺泡上皮细胞内过度表达,可使肺泡巨噬细胞释放的具有生物活性的TGF-β1,这是导致肺纤维化的关键因素[47]。