杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

摘 要
本研究旨在确定杜仲叶提取物中绿原酸的纯化工艺，并通过指纹图谱的建立来对产品的质量进行控制，再考察其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌的体外抑菌效果，为临床应用提供试验依据。试验所采用的纯化方法是大孔吸附树脂法，首先通过絮凝沉淀法来对样品进行预处理，然后再用高效液相色谱法建立绿原酸的指纹图谱；抑菌试验主要采用滤纸片法和连续梯度稀释法来观察和确定其抑菌效果和最小抑菌浓度；试验过程中绿原酸的含量测定则采用紫外分光光度和高效液相色谱两种方法。
试验结果表明：絮凝沉淀的最佳工艺条件为，10 mL pH=5的样品液中添加1 %醋酸壳聚糖溶液1 mL，在60 ℃的水浴中搅拌4 min，放置在4 ℃的环境中静置4 h，过滤后得到澄明度高的样品溶液；试验选取NKA-Ⅱ树脂，最终得到工艺条件为，样品溶液的pH=4，稀释倍数为6，上样速度为2 BV/h。 洗脱剂为70 %的乙醇，洗脱速度为2 BV/h，用量为2倍柱体积；抑菌试验结果为，6种细菌的抑菌环直径分别为13.44、18.12、13.56、14.00 、13.66、13.00 mm，其中药液对金黄色葡萄球菌高度敏感，对其它5种细菌中度敏感；前4种细菌的最低抑菌浓度为0.25 g/mL，溶液中绿原酸含量为3.58 mg/ml，其它两种的最低抑菌浓度为0.5 g/mL，溶液中绿原酸含量为7.20 mg/mL；试验最终成功建立了杜仲叶绿原酸分离物的指纹图谱，通过相似度分析，得出其对照指纹图谱与每批样的相似度均大于0.9，表明生成的对照指纹图谱可以代表10批样品的共同特征，可以作为应用本试验方法及条件分离纯化出的杜仲叶中绿原酸成分的指纹图谱。
综上所述，絮凝沉淀法和大孔吸附树脂法的连用可以有效的从杜仲叶绿原酸提取物中分离纯化出绿原酸，且分离出的物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌均具有抑菌作用。
关键词：杜仲叶；绿原酸；絮凝沉淀；大孔吸附树脂；指纹图谱；抑菌效果

第一章 文献综述
两千多年以前在我国的医药著作《神农本草经》中就已经有了关于杜仲的记载[1]。在中医的传统中杜仲以干燥的皮入药，然而剥皮极易导致树木的死亡，再加上树木成长速度有限，这两点就成为了杜仲药材资源缺乏的主要原因。因而，人们从大量废弃的杜仲叶入手，开始了以叶代替皮入药的研究。经研究发现杜仲叶与杜仲皮除个别化学成分外，其他有效成分基本一致[2]，其中杜仲叶中绿原酸的含量可达1-5.5%[3]，明显高于杜仲皮中绿原酸的含量。绿原酸是一类缩酚酸，主要是由咖啡酸和奎尼酸通过化学反应而得到。从国内外学者关于绿原酸的研究报道中知道，绿原酸具有提高机体免疫功能的作用[4]，还可以清除机体内的自由基，抑制氧自由基对机体的损失[5-6]。另有一些研究发现，绿原酸还具有降血糖、抗癌、抗病毒、抗菌等作用[7-10]。可见绿原酸具有很多的药理活性，再加上高纯度绿原酸更是难得，也就难怪其被称为“植物黄金”[11]。因此如何开发和利用低成本，高纯度的绿原酸就具有重要意义。
1.1 杜仲概述
1.1.1 引言
杜仲是杜仲科杜仲属的落叶乔木。16世纪在李时珍的著作《本草纲目》中写到 “昔有杜仲（人名）服此得道，思仲、思仙皆有此义”。通过李时珍的介绍让我们后人了解到杜仲名字的由来。
关于杜仲药效的阐述，在我国第一部药物专著《神农本草经》中早有了记载。后来的《本草纲目》及《本草备要》等著作中对杜仲的药理及药效进行了较详细阐述，如“味甘而辛，能入肝而补肾，能使筋骨相著”等。到了20世纪中期，很多国家包括我国、美国、日本等，通过关于杜仲的药理与临床应用的研究，最终证明了杜仲为天然高效的降压药物[12]。20世纪80年代，开始了关于杜仲叶医疗保健作用的系统研究，通过研究发现杜仲叶与杜仲皮的化学成分及作用相似，其中杜仲叶活性成分绿原酸的含量还高于杜仲皮[13-14]。而且研究还发现杜仲叶在抗衰老、抗疲劳、降压等方面具有更佳的效果。
1.1.2 杜仲叶的化学成分
杜仲叶含有木质素类化合物27种，环烯醚萜类化合物18种，黄酮类化合物6种，酚类化合物16种，氨基酸15种，挥发性成分35种，除此之外还含有大量的维生素、微量元素、杜仲胶、生物碱、多糖等[15]。在16种酚类化合物中有一种是抗癌、抗病毒、抗菌、提高机体免疫力的主要成分，该成分就是绿原酸。绿原酸在植物中分布广泛，目前我国多数是从金银花中分离得到绿原酸。随着对绿原酸的开发和利用的加大，人们在多种植物中均分离得到了绿原酸，如杜仲叶[16]、野菊花[17]、烟草[18]、咖啡豆[19-20]等。其中杜仲叶中绿原酸含量在0.8-2.9%[21]，还有文献报道其含量有的高达1-5.5%[22]。杜仲叶中绿原酸的含量虽不如金银花高，但是其资源的广泛及价格的低廉，就大大增加了杜仲叶开发和利用的价值。
1.2 绿原酸
1.2.1 绿原酸的理化性质
1897年Osbome和Campbell在向日葵籽中发现的一种化学物质。1909年经Gorter等人最终确定了此物质为绿原酸。绿原酸化学结构的首次确定则在1947年，由Rudkin与Nelson研究得出[23]。绿原酸的分子式为C 16H 18O 9，分子量为354.30，化学结构式如图1。
纯净绿原酸的颜色为白色或微黄色，它是一种针状结晶物。绿原酸的溶解性如下，在水、甲醇、丙酮中易溶解，如果在热水中溶解就会度更大。在乙酸乙酯溶液中绿原酸有微量溶解，在氯仿等弱极性溶剂绿原酸则很难溶解。由于绿原酸为缩酚结构，所以导致它的化学结构很不稳定。绿原酸在碱性溶液中容易变成橙色，而与稀酸溶液在共同加热的情况下，则易分解产生咖啡酸，遇铁易产生黑色化合物。绿原酸在高温及光照下极易分解，失去原有的活性，因而绿原酸应注意低温，避光保存。
图1 绿原酸结构式图
1.2.2 绿原酸的生物活性
（1）抗菌、抗病毒
通过报道可知，从不同植物中分离纯化得到的绿原酸，对多种致病菌有较好的抑制和杀灭作用。国外学者Bong与Guanghui等[24-25]的研究证实了绿原酸具有抑菌作用。而国内学者王海燕与王宏军等[26-27]通过对从烟草和金银花中分离得出的绿原酸抑菌效果的研究发现，绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等均具有一定的抑菌作用，而这些菌正是引起奶牛乳房炎的常见菌群。王海燕和王宏军的试验结果为研究开发治疗奶牛乳房炎的新药打开了一扇门。除此之外绿原酸还对枯草芽孢杆菌、根霉、青霉、黄曲霉、黑曲霉[28-29]等有一定的抑制作用。这些细菌及霉菌在腐败食品中很容易滋生，这一研究发现，为开发新型无污染的食品防腐剂提供了很有价值的参考。除此之外其对藤黄微球菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌[30-32]等也有一定抑制和杀灭作用。
绿原酸还有一定的抗病毒效果。通过研究发现其对抗猪细小病毒[33]及疱疹病毒1型[34]的感染有一定对抑制作用，除此之外绿原酸有潜在治疗禽流感病毒H5N1[35]及HIV[36]病毒的作用。
（2）抗氧化性
研究发现，绿原酸具有抗氧化性。绿原酸的化学结构中含有很多R-OH基，这一特殊结构使得绿原酸形成了具有抗氧化作用的羟自由基。这些具有抗氧化作用的羟自由基则用于消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基，发挥其抗氧化性。经报道，绿原酸抗氧化的能力要高于咖啡酸，丁香酸以及生育酚等常见的抗氧化剂[37]。
张星海等[38]通过从金银花中分离提取到的绿原酸对猪油抗氧化活性的研究，最后得出高纯度的绿原酸（含量81 %）拥有较强的抗氧化活性，而且随绿原酸浓度的增加抗氧化能力也增强。李文娜等[39]通过对杜仲叶中提取分离的绿原酸抗氧化活性的研究，结果得出，杜仲叶绿原酸提取分离物的抗氧化活性要比绿原酸标准品的抗氧化活性强。分析产生上述试验结果的原因可能是由于杜仲叶绿原酸提取分离物中还含有其他化学成分，或者这些化学成分相互作用，最终发挥了抗氧化活性，也可能是这些成分诱发绿原酸产生了新的抗氧化性成分。
抗氧化剂在食品、医药及日化等行业中一直占据了重要的位置。随着社会的发展，人们对身体的健康越来越重视，因而开发天然无污染的抗氧化剂更成为了大家的研究热点。因而绿原酸的这种生物活性为食品、医药及日化提供了有利的参考依据。
（3）对心血管系统的作用
绿原酸抗氧化作用的生物活性，使得绿原酸可以通过清除体内的自由基和抗脂质过氧化最终起到保护血管内皮细胞的作用。这是绿原酸具有预防动脉粥样硬化、高血压、血栓等心血管系统疾病作用的主要原因。通过Andersen等[40]研究结果，使我们知道绿原酸可以使钾离子的浓度升高，使三酰甘油及胆固醇等物质的水平降低，从而发挥其预防心血管系统疾病的作用。从Watanabe等[41]的研究我们知道，绿咖啡豆中分离得出的绿原酸提取物可以使鼠和人自发性高血压疾病的血压降低。
（4）其他生物活性
除以上生物活性外，绿原酸还具有抑制细胞的突变，以及对抗肿瘤的作用，因而绿原酸被认为是预防癌症的有效化学物质[42]。绿原酸还可以通过刺激胆汁的分泌从而达到利胆的功效。绿原酸还具有抗紫外线、抗辐射等功效，这为开发防晒等护肤品提供参考，现在已经有关于添加绿原酸的防晒霜的欧洲专利[43]产生。
1.2.3 分离纯化方法
（1）大孔吸附树脂法
大孔吸附树脂的发展是从20世纪60年代开始的，直到70年代后该技术在我国中草药的提取分离中被广泛应用。大孔吸附树脂结构中含有很多的大孔网，再加上它是一种有机高聚物吸附剂因此得名。使大孔吸附树脂发挥分离作用的是，它的网状孔径和较大的比表面积的结构特性，以及树脂的选择作用。因而在分离物质时，要根据物质的特性来选择不同极性的树脂，这样才能达到分离纯化的目的。
分子极性的大小、样品的pH值、上样液的浓度和速度、以及洗脱溶液的选择等在大孔吸附树脂分离纯化中药药液的过程中都有一定的影响。熊硕等[44]从8种不同极性的大孔吸附树脂中最终筛选出了对杜仲叶中的绿原酸吸附及解析效果最好的NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂，采用单因素试验确定了正交试验的因素和水平，最终通过正交试验得出了NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂分离纯化杜仲叶中绿原酸的最佳工艺，工艺参数为：样品质量浓度为4 mg/mL、上样速度为4 BV/h、样品体积为5 BV，洗脱剂为80 %的乙醇、洗脱剂流速为3 BV/h。
大孔吸附树脂因其理化性质稳定，吸附快，解析快，吸附容量大且容易再生，而被食品、医药等领域广泛应用。其在中草药有效成分的分离中的应用越来越受到重视。
（2）聚酰胺柱层析法
聚酰胺是一类高分子化合物，它是通过酰胺基聚合而成的。聚酰胺的物理特性如下，由于它的结构特征所以聚酰胺在水、甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂中不宜溶解，且在碱性条件下也很稳定，但是其在酸行条件下则稳定性很差，所以它可以溶解于浓盐酸、冰醋酸和甲酸中。聚酰胺的结构中酰胺键含量很丰富，而酰胺基团上含有的O、N原子，所以在酸性介质中O、N容易结合质子而带正电荷，可以与含有酚羟基的丰富的化合物，如酚类、酸类等形成氢键而被吸附，却与不能形成氢键的化合物分离。所以待聚酰胺对要分离的物质吸附完成后，再选取不同极性的物质作为洗脱剂，将吸附在聚酰胺上的物质洗脱下来，这就是应用聚酰胺分离纯化物质的主要原理。
郝凤霞等[45]应用聚酰胺方法，从金银花中分离出了绿原酸、黄酮、榭皮素和木犀草素，它们的含量分别为68.2 %、95 %、7.5 %、16.9 %。杨敏丽[46]，筛选了聚酰胺柱层析法的最优的工艺参数，从金银花中分离出了纯度为70 %的绿原酸。刘军海等[47]，应用聚酰胺柱层析法，从杜仲叶提取物中纯化出了绿原酸，最终得到的绿原酸纯度高达77.04 %。该方法虽然可以得到纯度很高的绿原酸，但是由于其操作比较麻烦，且产量低，洗脱时间又长，所以并不适合进行大规模的生产使用，主要是应用于分析研究中。
（3）超滤膜分离法
超滤膜分离法兴起的时间是20世纪60年代。超滤膜其实是一种选择透过性膜，它的工作原理主要是，在外力的作用下，小分子的物质可以通过滤膜，大分子的物质则不能通过滤膜，从而达到分离纯化的目的。
杨祖金等[48]研究了如何提高杜仲叶中绿原酸的转移率，试验通过对料液温度、超滤时间、膜截流量等因素的考察，最后得出的工艺参数如下：膜截留分子量为2000 00、超滤温度为40 ℃、超滤压力为0.36 MPa、时间为20 min、加水量为24 L时杜仲叶中绿原酸的转移率为99.38 %。范远景等[49]通过使用MF1-UF1-RO2膜组合来对金银花绿原酸提取液进行处理，最后得到了纯度为13.21 %以上的绿原酸溶液。超滤膜分离法虽然分离效率高且操作方便，但是其对提取液的预处理要求很高，且膜易阻塞，清理又很麻烦所以并不适用于大规模生产。

第六章 结论
6.1 絮凝沉淀法可以有效的除去杜仲叶绿原酸提取液中的部分杂质，使样品溶液达到澄清的目的。
6.2 大孔吸附树脂法，可以使杜仲叶绿原酸提取物达到纯化的目的。
6.3杜仲叶绿原酸分离提取物对金黄色葡萄球菌高度敏感，对大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌中度敏感。
6.4绿原酸分离物的对照指纹图谱可以作为应用本试验方法及条件分离纯化的杜仲叶中绿原酸的指纹图谱。