日本血吸虫重组SjTsp2Sj29kDa表膜蛋白疫苗

1 血吸虫病概述
　　　血吸虫病(schistosomiasis)是指由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种分布广泛、严重危害的人类的寄生虫病。在全球流行的传染病中，血吸虫病属于较为严重的。传播环节复杂，流行因素较多，并易受季节的影响，高危人群较集中以及居民的生产生活方式等导致了血吸虫病的防治难度较高。目前在亚洲、非洲和南美洲的 76个国家流行, 有 6 亿人受到威胁，2 亿人受感染，全世界每年约有数十万人死于该病[1]。根据2011年全国血吸虫病疫情通报，我国尚有454个血吸虫病流行县(市、区)，共有31303个流行村，估计患者28万余例，全国现有钉螺面积372 664．10 hm2,其中新发现钉螺面积1 163．87 hm2 [2]。可见，血吸虫病的防治仍然是我国疾病防治的重中之重。
　　　灭螺和吡喹酮的使用是目前防治血吸虫病主要措施，吡喹酮是现今唯一有效的化疗药物，但它虽能降低感染率和发病率，却不能阻断血吸虫的传播途径，对已经引发的肝脾损害没有明显的作用，感染者经药物治疗后再次接触疫水仍会发生重复感染。另有文献资料显示，药物的长期使用可能会引起血吸虫潜在抗药性。因此，研制一种安全、有效且可持续免疫保护效果的抗血吸虫病疫苗有利于长期控制血吸虫病以及提高化学疗法的效果[3-4]。
　　　
2 血吸虫病疫苗的研究

　　　血吸虫病疫苗是血吸虫病防治措施的一个重要补充，它的研究已有 80 多年的历史，经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程重组疫苗、抗独特性抗体疫苗、DNA 疫苗、复合肽疫苗、载体与佐剂的应用等几个阶段，目前研究主要集中在蛋白质疫苗、DNA 疫苗和血吸虫联合疫苗等几个方面[1]。
2.1蛋白质疫苗
　　　蛋白质疫苗是血吸虫病疫苗主要类型之一，其种类较多，重组蛋白疫苗是其中的一种，重组蛋白疫苗是将具有保护性的抗原分子的基因(或抗原决定簇基因片段)插入载体(如质粒)中,将重组分子导入受体细胞(如大肠杆菌)中进行表达,并用蛋白质纯化技术将表达的目的蛋白进一步分离纯化，纯化后的蛋白通过佐剂乳化后制成疫苗，进行免疫[5]。
　　　目前为止，重组抗原的研究主要处在血吸虫尾蚴、童虫、成虫和虫卵等几个阶段[6]。其候选抗原分子有副肌球蛋白、谷光甘肽转移酶(GST)、磷酸丙酮异构酶、照射减毒抗原 5（Irv-5）、完整膜蛋白（Sm23）和脂肪酸结合蛋白（Sm14）、信号蛋白 14-3-3、重组蛋白和表位肽、钙离子激活蛋白激酶、磷酸甘油醛脱氢酶等，其中前6种被世界卫生组织热带病特别规划署（WHO/TDR）认定为重组血吸虫病疫苗候选分子[7]。现将各个候选分子的研究进展分述如下：
⑴ 谷胱甘肽-S-转移酶（GST）
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是一组同工酶，其共同底物为谷胱甘肽　　　血吸虫含有丰富的GST，存在于成虫的实质组织实质细胞内。日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白经基因工程技术表达，刺激人体免疫系统产生强烈的、T细胞依赖的、针对性很强的免疫反应；同时还能明显诱导抗尾蚴的攻击感染和抗生殖的保护性免疫反应[8]。曾有研究用含重组谷胱甘肽-S-转移酶基因的抗原免疫水牛，能诱导机体产生保护性免疫反应，预防血吸虫尾蚴感染，还能抑制宿主体内雌虫的产卵。实验动物体内成虫数、虫卵数均有明显的减少，对于肝组织肉芽肿病变也有明显的减轻，另外粪便中虫卵的孵化率降低约400%[9]。
　　　⑵ 磷酸丙糖异构酶(TPI)
　　　磷酸丙糖异构酶(TPI)相对分子质量约为 28000，在血吸虫各个阶段细胞里几乎都有TPI的存在，它可以催化糖酵解(EMP)途径中磷酸二羟丙酮（DHAP）与 3-磷酸甘油醛（GAP）可逆反应，它是血吸虫生命代谢活动的重要功能分子之一，催化磷酸二轻丙酮分子和磷酸甘油醛之间的可逆反应，是参与血吸虫糖代谢过程的一个关键酶[10 ]。
　　　⑶ 副肌球蛋白(paramyosin)抗原
　　　副肌球蛋白是一种肌原纤维蛋白，分子量为 97kD，主要位于血吸虫肌组织内，尾蚴的呼吸盘腺体内也存在这种蛋白。该蛋白质不仅参与虫体本身肌纤维功能，还能与动物和人的抗体 Fc 片段结合，抑制补体介导的免疫反应。在虫体发育过程中副肌球蛋白抗原会结合到虫体表面，虫体在移行时该蛋白即成为靶抗原诱导产生保护性免疫，在人抗血吸虫感染的免疫过程中该蛋白主要引起IgA 免疫应答。以往研究表明，副肌球蛋白能刺激小鼠引起免疫反应，产生 IFN-γ，并活化巨噬细胞，对入侵童虫具有杀伤力[11 ]。
　　　⑷ 照射减毒抗原 5（Irv-5）
　　　科研人员曾发现辐射减毒曼氏血吸虫尾蚴后免疫动物，能获得较高水平的免疫保护效果，单次免疫保护率达 50-70%，加强免疫后高达80-90%。大量实验采用免疫血清学分析，最终发现了 5 种童虫和 7 种成虫糖蛋白抗原，其中就包括照射减毒抗原 5（Irv-5），在用重组的SjIrv-5做抗原的免疫动物实验中，得到60-80%的免疫保护率[12]，并被证实其发生的免疫机制与 Th2引起的免疫反应相关[13]。
　　　⑸ 膜相关抗原(Sm23)
　　　23kDa膜蛋白，相对分子质量为 23 000，它是膜蛋白超家族TM4SF的成员之一。存在于血吸虫尾蚴、童虫及成虫中。 Sj23 与人的多种表面蛋白具有高度同源性，在血吸虫生长和发育的过程中起着重要的作用。Sm23本身具有T细胞和B细胞两种表位，它有很高的免疫原性主要归因于分子外部的两个亲水区[14]。林矫矫等应用PCR技术首先编码克隆日本血吸虫（中国大陆株）23kD抗原的大亲水区多肽的DNA片段即LHD-Sj23，构建重组LHD-Sj23/pGEX抗原，并将该重组抗原免疫小鼠与绵羊，得到的减虫和减卵率都在50%以上，显现出了该重组抗原具有较高的免疫保护作用[15]
　　　⑹ Mr14000 的脂肪酸结合蛋白（FABP）
　　　Gobert[16]等人进行免疫定位日本血吸虫脂肪酸结合蛋白，首次发现SjFABP主要存在于雌虫皮下脂质小滴内及雌虫卵黄腺内的卵黄小滴内。Becke 等[17]通过大量的实验得出脂肪酸结合蛋白是抗血吸虫作用的重要靶标，因为血吸虫自身不能合成脂肪酸及固醇类物质，必须依赖宿主提供。脂肪酸结合蛋白的作用是吸收、运输和吞噬宿主体内各种衍生的脂肪酸，所以在血吸虫脂代谢过程中FABP 起着重要作用，依此该蛋白可以作为药物靶蛋白，也可以作为疫苗的候选分子。但是该蛋白在各种动物实验中获得的减虫率并不一致，其免疫保护效果有待进一步研究[18]。
　　　⑺ 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）
　　　血吸虫成虫必须生活在一个有氧的环境中，它可以维持自身的氧化还原平衡。同时血吸虫依赖于谷肤甘肤和硫氧还蛋白两个系统以躲避宿主免疫系统的活性氧的伤害[19]。曾有实验得出，硫氧还蛋白可以表达于血吸虫的发育和繁殖阶段，并且虫卵分泌产物中含有硫氧还蛋白同时又出现在抗融合蛋白产生的环沉淀素反应的抗体中。另外还有学者发现硫氧还蛋白是一种特异性的虫卵抗原，诱导感染血吸虫的小鼠产生特异性的IgG抗体。以上结果证明硫氧还蛋白与血吸虫生存相关联，它可以抵制宿主的炎性反应对虫卵的伤害[20]。
　　　⑻ 四跨膜蛋白超家族(TM4SF)
　　　四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)多种组织、细胞的膜组成成分，其分子量仅在20-50kDa之间，属于分子量较小的糖蛋白，它包括20多个成员[21]。该家族的重要成员Tetraspanins是一种细胞膜蛋白，表达于多个物种中，属于细胞膜糖蛋白中特殊家族[22]。血吸虫体被外表膜有多种四跨膜蛋白[23]。Tran, M. H.等[24]通过信号序列捕获技术发现了两个TSP 家族成员—SmTsp1和 SmTsp2，实验研究得出其中的SmTSP2 融合蛋白免疫小鼠后，减虫率57%、肝脏减卵率64%和粪减卵率69%。在曼氏血吸虫病动物实验中，用重组蛋白rSmTSP2 做抗原免疫小鼠，获得减虫率57%和肝脏减卵率64%[25]。而日本血吸虫体被表达的TSP2 蛋白作为抗原诱导的免疫保护效果并不稳定。有实验室将SjTSP2扩增了膜外大环区，亚克隆至 pET32a质粒中表达了Trx-TSP2 融合蛋白，免疫动物后获得 56%的减虫率、53%的肝脏减卵率以及 52%的粪减卵率[26]。
　　　⑼ Sm29
　　　Cardoso等[27]发现受感染人群血液中国出现较高水平的抗 Sm29 的 IgG1 和 IgG3，其后通过大量实验和生物信息学确定Sm29 蛋白是曼氏血吸虫高表达的跨膜分子。通过动物实验，用重组的Sm29 蛋白免疫小鼠获得 51％减虫率、60％减卵率和 50％减肉芽肿，显示Sm29 蛋白具有较好的免疫保护效果。蛋白序列同源性分析发现Sm29与日本血吸虫一些蛋白有较高的相似性，分别是：37% (SJCHGC02532)，49%(SJCHGC05578)，52% (SJCHGC05668)和53% (SJCHGC03008)[28]。这为研究日本血吸虫病疫苗候选分子提供了很有价值的参考。
2.2 DNA疫苗
　　　DNA疫苗又称核酸疫苗，即把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA注射到动物体内，体内表达并诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫反应，从而达到防御疾病的目的[29]。1990年Wolff等[30]首次报道了DNA疫苗的研究成果。1995年Yang等[31]首次提出了用编码血吸虫候选疫苗Sj 97即日本血吸虫副肌球蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST) Sj26全长的cDNA片段构建DNA疫苗。随后相关DNA疫苗的研究工作迅速开展起来，DNA疫苗的研究成为血吸虫病疫苗研究的主流方向。迄今为止日本血吸虫DNA疫苗还有SjTPI、Sj22.6、Sj23、Sj28-GST、SjHGPRT和SjSDISP 等，这些 DNA 疫苗可诱导宿主产生较高水平的特异性抗体获得一定的保护效果[7]。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有高效、持久、广谱、简便和廉价等优点,将不同病原体的DNA序列克隆到合适的载体中，通过诱导表达后输入机体，可起到增强免疫效果的作用[32]。
　　　核酸疫苗接种后可能在以下两个方面发挥作用：一方面是DNA转入皮肤后，可导致抗原提呈细胞(APC)的激活，进而摄取和表达抗原或接受周边其他细胞成分传递的抗原，接着转给T细胞(Th)和细胞毒性T细胞；另一方面是DNA转入肌细胞后，在肌细胞内表达或其死亡后释放进入细胞间质，被免疫细胞主要是APC摄取并表达抗原，再转送给Th和CTL，肌细胞本身也可直接转移或呈递抗原[33]。然而由于宿主激发抗血吸虫免疫的不完全性，血吸虫基因的复杂性以及生物长期进化过程中产生的免疫逃避等功能, 使得单一抗原分子诱导宿主产生的免疫保护力往往不尽人意[34]。另外DNA疫苗本身还存在一些问题，如：疫苗刺激人体产生的免疫反应较自然蛋白的免疫反应弱；低水平表达及因此而导致机体的免疫耐受；外源DNA的插入是否会激活原癌基因还尚无定论[35]。为了改善疫苗的效果, 研究趋向于选择用多个不同表位的抗原组合，协同作用, 以期取得较好的免疫保护力[36]。因此联合多种日本血吸虫病疫苗候选分子将成为众多学者们关注的焦点。
2.3 血吸虫病联合疫苗
　　　随着生物技术的发展以及免疫方法和途径的不断创新过程中，增强血吸虫病疫苗免疫保护作用的稳定性和高效性是研究血吸虫病疫苗重中之重。曾有报道称联合DNA疫苗和蛋白疫苗已用于疟疾、结核病、AIDS等疾病的疫苗研究中，并且起到了增强疫苗保护效果的作用[37-39]。这种途径可以发挥两种疫苗在宿主体内诱导免疫应答的不同优势，从而增强疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果。目前血吸虫混合疫苗中有蛋白(重组蛋白和表位肽)的混合疫苗，DNA的混合疫苗，蛋白与DNA的混合疫苗[6]。
鸡尾酒式DNA混合疫苗是联合疫苗的一种方式，即将多种表达不同表位抗原的基因重组疫苗简单的混合到一起所制成的一种混合疫苗，是提高日本血吸虫单一核酸疫苗的免疫保护效果的最简单的方法。主要包括多种重组核酸疫苗混合、重组蛋白疫苗与DNA重组疫苗混合两种方式[40]。 以往有研究说明，日本血吸虫鸡尾酒式DNA混合疫苗免疫小鼠后， 其免疫效果较单一疫苗明显增强。胡媛等[41]用双价共表达疫苗Sj23/SjFABP与双价融合表达疫苗Sj23/SjFABP混合，免疫小鼠后获得的减虫率为58.97%。余光清等[42]将Sj26GST DNA疫苗与rSj26GST混合，研究其免疫保护效果，得到50.8%的减虫率。吴平等[43]采用SjRPS4基因与蛋白疫苗联合免疫小鼠，获得减虫率49.70%。 刘秉春等[44]采用核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫的方式，将DNA 疫苗初免、蛋白疫苗加强的联合免疫，得到减虫率 (42.3％) 和减卵率 (59.6％)，同时能够显著减轻血吸虫虫卵对肝脏的病理损害。从以上研究结果可以看出，与单一的DNA疫苗相比较，鸡尾酒式DNA混合疫苗的免疫保护效果明显增强，其免疫机制可能归因于选取的不同抗原诱导了不同的免疫反应，产生了细胞介导或抗体介导的免疫机制，从而达到较高的免疫保护效果。
　　　添加佐剂的重组DNA联合疫苗也属于血吸虫病联合疫苗，DNA疫苗的佐剂是新的血吸虫病疫苗研究热点[29]。佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对该抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。DNA疫苗佐剂主要有免疫刺激DNA序列（ISS）、细胞因子、脂质体三大类，ISS主要通过刺激单核/巨噬细胞产生细胞因子、刺激B细胞的增值及产生抗体，从而增强DNA疫苗的免疫效应；细胞因子具有佐剂和免疫增强作用；脂质体则可能是通过DNA-脂质体复合物缓慢释放出DNA，从而发挥长效、持续作用来增强免疫效应[45]。冯清等[46]在以天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂,探讨其对DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj23增效作用的研究中得出减虫率和减卵率分别为64.3%和79.9%，较对照组免疫保护效果明显增强。鲁燕妮等[47]在探讨植物多糖佐剂对血吸虫病疫苗的增效机理的研究中，采用从香菇中提取的多糖作为佐剂进行动物实验,得出多糖佐剂实验组减虫率（70.8%）和减卵率（84.8%）明显增强。以上实验结果表明，联合适当的佐剂，可以增强DNA疫苗的免疫保护效果。
　　　
3 血吸虫病疫苗研究面临的问题与展望

长期以来，对于日本血吸虫病疫苗的研究，虽然人们已经发现了许多分子作为抗原候选分子，具有部分免疫保护效果，但至今仍未获得一种能够有效防治日本血吸虫病的疫苗，所以寻找可产生长期效用的血吸虫病疫苗，一直是众多学者们奋斗的目标。为了推进血吸虫病疫苗研究工作，世界卫生组织热带病研究培训特别规划署（WHO Special Programme for Research an Training in Tropical Diseases,TDR）将血吸虫病疫苗研制置于血吸虫病防治研究的优先地位。在我国，日本血吸虫病基因工程疫苗项目已纳入了国家 863、973 等高技术计划范畴。
　　　然而在血吸虫病疫苗研究过程中还存在着一些问题：
　　　⑴ 目前已被鉴定的抗原分子的免疫保护力不高。科学家们曾以小鼠为模型对6 种血吸虫病疫苗候选分子进行评估，结果都没有达到 40%或者更高的预期保护力[48]，所以在疫苗的研究中，如何提高疫苗的免疫保护效果是关键点之一。
　　　⑵免疫逃避现象。血吸虫免疫逃避机制有可能降低疫苗诱导的保护力水平或宿主产生的保护性免疫应答。日本血吸虫虫体表面存在许多抗原分子，它往往会结合宿主自身抗原，逃避宿主免疫系统的识别。另外，疫苗免疫保护力的保持力需要时间和大量实验来证明。
　　　⑶实验动物与人的免疫系统之间的差异。截至目前血吸虫病疫苗研究处于动物模型实验的阶段，实验动物产生的免疫机制与人体差异很大，而疫苗本身对于动物的不良反应还尚不明确，所以导致实验动物得出的结论很难完全适用于人体。
血吸虫病疫苗的研究任重而道远，可能需要几代人的努力去逐步实现，过程很艰难，但是科学家们会竭尽全力。近几年，科学家们有了一些新的思路：(1) 对新型疫苗候选抗原的筛选。Hu Wei等[49]针对日本血吸虫各种生活阶段的全基因组序列进行分析，获得了 43707 个表达序列标签（ESTs），共 13131 个基因种类。Liu Feng 等[50]通过比较蛋白质组学和比较转录组学的方法，对日本血吸虫各发育阶段及卵壳、体被表达的蛋白进行比较分析、鉴定，获得 3260 个蛋白；(2) 多表位、多价疫苗或混合使用不同抗原疫苗，能协同发挥作用，针对不同虫期的抗原杀灭虫体，从而有效提高疫苗的免疫保护效果[52]；(3)新的疫苗递送技术，如新的佐剂、纳米材料、脂质体等，佐剂的使用在疫苗免疫的过程中起到促进和提高免疫保护效果的作用，因此，选择适当的佐剂是有利于疫苗效果的提高；(4)加强对宿主免疫机制的研究。通过研究充分了解宿主感染血吸虫后所引起的免疫反应，将有利于发现更好的抗日本血吸虫病疫苗。