胎膜早破孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT、NE的表达及其与组织学绒毛膜羊膜炎的关系

摘 要
　　　胎膜早破（premature rupture of the membranes,PROM）即临产前发生胎膜破裂。其发生率，国外报道为5%～15%，国内为2.7%～7%。未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the membranes pPROM）是指妊娠20周以后、未满37周，在临产前发生的胎膜破裂。发生率为20%～3.5%。PROM是产科常见的妊娠期并发症，且近年发病呈上升趋势。关于PROM的发病原因，主要包括生殖道感染、羊膜腔压力增高、营养因素及其它，如：细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α升高，激活溶酶体酶，破坏羊膜组织导致胎膜早破；此外，羊膜穿刺不当、人工剥膜、妊娠晚期性生活频繁等均有可能导致胎膜早破。目前国内外研究较多的是PROM与感染的关系[1]。
　　　PROM与感染互为因果，PROM合并感染后可表现为临床绒毛膜羊膜炎和组织学绒毛膜羊膜炎（HCA），临床绒毛膜羊膜炎患者和胎儿可有临床表现，而HCA患者多表现为亚临床感染。PROM合并HCA可导致孕妇发生胎盘早剥、产后出血、产褥感染、败血症等围产期并发症；新生儿发生感染性疾病如：新生儿肺炎、脑白质损伤的机率增加。因此提早预测HCA的发生具有重要意义。
　　　氧化型α1-抗胰蛋白酶（ox-AAT）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）即与PROM的发生有关又在炎症瀑布反应中起调节作用。因此，本研究通过检测PROM患者外周血、新生儿脐血及胎膜组织中ox-AAT和NE的表达变化，探讨其与PROM合并HCA的关系，期望寻找预测PROM合并HCA的实验室指标。
目 的
本研究通过检测比较PROM孕妇血清、新生儿脐血血清及孕妇胎膜组织中ox-AAT和NE的水平有无差异，探讨PROM孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT和NE的表达变化与HCA的关系。
　　资料与方法
1 研究对象：
　　　选择2012年9月至2013年3月在郑州大学第三附属医院住院分娩的PROM孕妇60例，年龄为18岁～40岁，孕周为30+6周～40+2周。PROM的诊断参照谢幸、苟文丽主编的《妇产科学》第8版[1]。排除有临床感染症状（孕妇T>37.8℃、P>120次/分、胎儿HR>160次/分，伴下列两条标准中的任意一条：子宫压痛或羊水有臭味）、肝炎、肾炎、上呼吸道感染等感染性疾病的PROM孕妇。根据产后胎盘组织的病理结果（每高倍镜下炎性细胞数量>5个）[2,3]分为HCA组（PROM合并HCA）及对照组（未合并HCA）。新生儿感染性疾病的诊断以新生儿科诊断为准。
2 实验方法：
2.1 血清标本采集：入选孕妇，入院后未应用抗生素前，留取外周血5ml，3500r/min离心10min，取上清液-80℃保存。胎儿娩出后，胎盘娩出前留取脐血5ml，处理同孕妇外周血。
2.2 胎盘组织标本采集：胎盘娩出后取胎膜破口至胎盘边缘的胎膜，冷生理盐水冲洗表面血迹，使成卷状，用大头针固定，放入冻存管，迅速投入液氮。同时避开钙化点取2cm×2cm大小胎盘全层3块～4块，用甲醛固定，行病理检查，根据病理检查结果分组。
2.3 采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)法检测孕妇外周血、新生儿脐血中ox-AAT和NE的水平。
2.4 采用逆转录PCR技术检测胎膜组织中ox-AAT mRNA、NE mRNA的表达水平。
3 统计学方法：
　　　应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用x±S表示；组间比较采用独立样本的t检验或秩和检验;计数资料采用率表示,组间比较用2检验;相关性分析采用Pearson相关分析。所有检验水准为“α=0.05”。
结 果
1 HCA组和对照组孕妇一般临床资料的比较：
　　　两组孕妇的年龄、产次、分娩孕周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；HCA组孕妇破膜-胎儿娩出时间、WBC计数及CRP水平较对照组高，但差异均无统计学意义（P>0.05）。
2 60例PROM孕妇HCA的发生情况
60例PROM患者中HCA组22例，对照组38例；HCA的发生率为：36.7%。 3 两组孕妇外周血和新生儿脐血中ox-AAT及NE的表达水平
　　　HCA组孕妇血清中ox-AAT（2.328±0.014）ng/L和NE（0.407±0.082）ng/L水平均高于对照组（1.503±0.12、0.260±0.090）ng/L（P<0.05）;HCA组新生儿脐血中ox-AAT（2.920±0.182）ng/L和NE（0.744±0.065）ng/L水平均高于对照组（2.433±0.004、0.415±0.010）ng/L （P<0.05）。4 两组胎膜组织中ox-AAT mRNA及NE mRNA的水平　　　HCA组胎膜组织中ox-AAT mRNA(0.960±0.03)和NE mRNA(0.670±0.075）水平均高于对照组(0.532±0.01、0.271±0.09）（P<0.05）。5 相关性分析5.1 HCA组孕妇外周血中ox-AAT的水平与脐血中ox-AAT的水平具有正相关性，r=0.825，P<0.05;HCA组孕妇外周血中NE的水平与脐血中NE的水平呈正相关r=0.847，P<0.05。5.2 HCA组孕妇外周血中ox-AAT与NE具有正相关性，r=0.885，P<0.05；新生儿脐血中ox-AAT与NE具有正相关性，r=0.756，P<0.05；胎膜组织中ox-AAT和NE具有正相关性，r=0.876，P<0.05。6 两组产妇及新生儿结局的比较 60例孕妇中无一例合并胎盘早剥、产后出血及产褥感染。HCA组以剖宫产终止妊娠者18例，对照组9例，组间比较，差异有统计学意义（2=12.59，P<0.05）。60例新生儿，HCA组中1例因败血症死亡，无新生儿脐炎及坏死性肠炎发生，15例发生肺炎，对照组中13例发生肺炎，组间比较差异有统计学意义（2=6.461，P<0.05）。结 论1 孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT、NE水平升高与PROM合并HCA密切相关。2 ox-AAT和NE有望成为预测PROM合并HCA的指标。　　　关键词：组织学绒毛膜羊膜炎 氧化型α1-抗胰蛋白酶 中性粒细胞弹性蛋白酶 新生儿 1 引言　　　胎膜早破（premature rupture of membrane，PROM）即临产前发生胎膜破裂。其发生率国外报道为5%～15%，国内为2.7%～7%。未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the membranes pPROM）是指妊娠20周以后、未满37周胎膜在临产前发生破裂。发生率为2%～3.5%。胎膜早破可引起早产、胎盘早剥、羊水过少、脐带脱垂、胎儿窘迫和新生儿呼吸窘迫综合征，孕产妇及胎儿发生感染性疾病的机率和围产儿病死率显著升高。导致胎膜早破的因素很多，常是多因素相互作用的结果，主要包括①生殖道感染：病原微生物上行性感染，引起胎膜炎，细菌可以产生蛋白酶，胶质酶和弹性蛋白酶，这些酶可以直接降解胎膜的基质和胶质，使胎膜局部抗张能力下降而破裂；②羊膜腔压力增高：宫内压力增加，覆盖于宫颈内口处的胎膜自然成为薄弱环节而容易发生破裂；③胎膜受力不均；④营养因素：缺乏维生素C、锌及铜，可使胎膜抗张能力下降，易引起胎膜早破；⑤其它：细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α升高，可激活溶酶体酶，破坏羊膜组织导致胎膜早破；⑥羊膜穿刺不当、人工剥膜、妊娠晚期性生活频繁等均有可能导致胎膜早破。　　　破膜后①对母儿会产生影响：阴道内的病原微生物易上行感染，感染程度与破膜时间有关，超过24小时，感染了增加5～10倍；若突然破膜，有时可引起胎盘早剥；羊膜腔感染易发生产后出血；②对胎儿的影响：围产儿死亡率为2.5%～11%，常诱发早产；早产儿易发生呼吸窘迫综合征；并发绒毛膜羊膜炎时，易引起新生儿吸入性肺炎；严重者发生败血症、颅内感染等危及新生儿生命；脐带受压、脐带脱垂可导致胎儿窘迫。破膜时孕周越小，胎肺发育不良发生率越高；如破膜-分娩时间长于4周，羊水过少程度重，可出现明显胎儿宫内受压，表现为铲形手、弓形腿、扁平鼻等。 氧化型α1-抗胰蛋白酶(ox-AAT)是α1-抗胰蛋白酶（AAT）的氧化形式，AAT是一个52KDa抗炎循环糖蛋白，主要由肝脏合成，单核细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞和人羊膜上皮细胞也有合成AAT[4、5]。炎症细胞释放的炎症因子可使AAT的活化位点-蛋氨酸51、358位点被氧化，蛋氨酸残基被氧化成蛋氨酸亚砜，并覆盖AAT的活性位点，即ox-AAT，后者失去抗炎、抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的活性[6]，一方面导致基底膜溶解，促进胎膜发生破裂，一方面活化募集单核细胞到炎症部位进一步加重炎症，促进组织破坏。　　　NE作为重要炎性损伤因子，是中性粒细胞内溶酶体释放的主要蛋白水解酶，可以降解细胞外基质，本身又可促进细胞释放炎性因子如：IL-1、IL-8等，从而使中性粒细胞趋化、迁移，损伤组织[7、8、9]。 本实验根据分娩后胎盘组织的病理结果将60例PROM孕妇分为组织学绒毛膜羊膜炎（HCA）组及对照组。通过采用固相夹心酶联免疫吸附(enzyme 1inked immunosorbent assay，ELISA)法检测孕妇外周血及新生儿脐血中ox-AAT、NE的水平；逆转录-PCR技术检测胎膜组织中ox-AAT mRNA及NE mRNA的表达水平；对母血与脐血中ox-AAT、NE 的相关性及母血、脐血、胎膜组织中ox-AAT与NE的相关性进行分析，并统计分析孕妇及新生儿结局。探讨PROM孕妇外周血、脐血和胎膜组织中ox-AAT和NE的表达变化与HCA的关系。2 资料与方法2.1 研究对象2.1.1 研究对象 选择2012年9月至2013年2月在郑州大学第三附属医院住院分娩的PROM孕妇60例。根据产后胎盘组织的病理结果（每高倍镜下炎性细胞数量>5个）[1,3]分为HCA组和对照组。新生儿感染性疾病的诊断以新生儿科诊断为准。其中：
（1）HCA组：合并HCA的PROM孕妇22例。
（2）对照组：未合并HCA的PROM孕妇38例。
年龄为18岁～40岁，孕周为30+6周～40+2周，排除有临床感染症状（孕妇T>37.8℃、P>120次/分、胎儿HR>160次/分、伴下列两条标准中的任意一条：子宫压痛或羊水有臭味）、肝炎、肾炎、上呼吸道感染等感染性疾病的PROM孕妇。
2.1.2 诊断标准
胎膜早破诊断标准：PROM的诊断参照谢幸、苟文丽主编的《妇产科学》第8版[1]。胎膜早破（premature rupture of membrane，PROM）即临产前发生胎膜破裂。未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the membranes pPROM）是指妊娠20周以后、未满37周胎膜在临产前发生的胎膜破裂。根据临床表现、阴道液PH≥6.5及阴道后穹隆积液涂片，干燥后镜检可见羊齿状结晶诊断胎膜早破，准确率达90%；此外，宫颈及阴道分泌物内胎儿纤连蛋白（fetal fibronectin,fFN），羊水中胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）及B型超声测量羊水量减少可协助诊断。
临床绒毛膜羊膜炎的诊断：孕妇R≥100次/分、胎儿HR≥160次/分、T≥38℃、子宫激惹、羊水恶臭、母体白细胞计数≥15×109/L、中性粒细胞≥90%.出现上述任何一项表现应考虑有临床绒毛膜羊膜炎。
组织学绒毛膜羊膜炎诊断：产后胎盘组织的病理结果显示：每高倍镜下炎性细胞数量≥5个。
5 细胞因子与妊娠期合并肝内胆汁淤积症的相关性
　　　妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnacy,ICP）是妊娠期特有的并发症，发病率0.1%～15.6%不等，有明显的地域和种族差异，我国长江流域等地发病率较高。以妊娠中、晚期出现皮肤瘙痒和黄疸为主要临床表现，主要危害胎儿，使围产儿病死率增高，血清胆汁酸升高是最主要的特异性实验证据。关于ICP的病因，目前尚不清楚，可能与雌激素、遗传及环境等因素有关。临床发现ICP多发生在高雌激素水平状态，雌激素可使NA+、 K+-ATP酶活性下降，能量提供减少，导致胆汁酸代谢障碍；雌激素可使肝细胞膜中胆固醇与磷脂比例上升，胆汁流出受阻，诱发ICP。此外，ICP的发病与季节有关，冬季高于夏季；妊娠妇女血硒水平降低，导致谷胱甘肽过氧化酶活性降低，增加患ICP的机率。
　　　既往对ICP的研究多是临床观察分析，近年来，对ICP的研究已深入到分子水平。免疫因素是研究的热点。Th1与Th2细胞因子的平衡是维持正常妊娠的重要表现，Th1与Th2的失衡是许多疾病发生的原因所在。正常妊娠时Th2起主导作用，维持母胎界面的免疫平衡。许多研究发现，ICP患者Th2优势向Th1方向偏移，导致母胎间免疫反应增强，使免疫耐受受到抑制。有学者[81]对ICP患者的胎盘进行组织学形态观察发现：ICP患者胎盘的绒毛合体结界增多，绒毛间质水肿伴空泡形成、绒毛间腔狭窄、滋养层细胞肿胀及绒毛纤维素样坏死。
　　　此外，细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling3,SOCS3）是由细胞因子受到诱导后产生，对信号通路有负反馈调节的蛋白分子，而且，可以调节Th1/Th2细胞因子向Th2偏移[82]。有研究认为，SOCS3的缺乏与妊娠失败及妊娠并发症的发生有关，可使母胎界面的免疫状态受到影响[83]。有研究证明[84]，IFN-、TNF-α在ICP患者外周血中的水平显著高于正常妊娠妇女，IL-4水平显著下降。这些都提示ICP患者存在Th2向Th1偏移，细胞因子在ICP的发生中起重要作用。国内张丽娟等[85]实验证明以上结果，并且发现：SOCS3在ICP孕妇胎盘组织中的表达较正常孕妇低，与病情的轻重呈负相关。推测SOCS3参与ICP的发病，SOCS3水平降低，对IFN-及IL-10的抑制作用减弱，导致IFN-高表达、IL-10表达减少，使Th2向Th1漂移，促进ICP的发生。