戊乙奎醚对内毒素致新生大鼠肠损伤时缺氧诱导因子-1α及谷氨酰胺表达的影响

摘 要
新生儿肠损伤是儿科常见的疾病之一，其发生的主要原因有早产、窒息引起的缺血缺氧以及感染等。其中严重感染常可导致危重患儿胃肠功能衰竭。肠道在全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展过程中扮演着极其重要的角色。肠道感染或缺血缺氧会导致肠粘膜屏障功能受损，引起细菌及内毒素的移位，引发败血症和脓毒性休克，从而进一步加重肠组织的损伤，甚者可伴随远隔器官受累。LPS作为典型的内毒素, 可诱发内毒素血症，导致肠黏膜损害。国内外诸多研究发现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和谷氨酰胺（Gln）在内毒素性肠损伤的病理改变过程中具有重要作用。盐酸戊乙奎醚（PHC）是我国自主研制的抗胆碱药。研究表明，盐酸戊乙奎醚因能改善微循环、降低毛细血管壁通透性和减少溶酶体释放而具有多器官保护作用。目前盐酸戊乙奎醚对内毒素性肺损伤的保护作用得到了广泛地证实和认可，我们通过大量的临床观察发现盐酸戊乙奎醚在解除肠痉挛、减轻肠道水肿方面同样具有良好的效果。基于以上背景，本课题旨在研究内毒素致新生大鼠肠损伤时盐酸戊乙奎醚预先给药对肠组织HIF-1α和Gln表达的影响，以及对其肠保护作用机制进行初步探讨。
目 的
探讨盐酸戊乙奎醚预先给药对内毒素致新生大鼠肠损伤时HIF-1α和Gln表达的影响及其肠保护作用相关机制，为临床防治新生儿肠损伤提供一条新的思路。
材料与方法
1. 研究对象
60只SPF级健康新生7日龄SD大鼠，由郑州大学河南省实验动物中心提供，雌雄不限，体重18±2g。
2. 实验方法
2.1 实验动物分组
本实验分为两部分。第一部分：将30只幼鼠随机分为3组，每组10只。分别为对照组（C组）、肠损伤模型组（L组）和盐酸戊乙奎醚干预组（P组），用以测定肠组织湿/干重比、观察肠组织形态学的改变和检测肠组织中细胞因子的表达。第二部分：30只幼鼠同样随机分为3组，C组4只，L组和P组各13只，用以观察造模后幼鼠行为学的变化并计算每组24h生存率。
2.2 动物模型的制备
肠损伤模型组腹腔注射内毒素（细菌脂多糖LPS，E.Coli 055：B5，Sigma公司，美国）5mg/kg，配制浓度为0.5mg/ml；盐酸戊乙奎醚干预组在注射内毒素前30min，先腹腔注射盐酸戊乙奎醚（成都力思特制药股份有限公司，批号：120603）2mg/kg，配制浓度为0.05mg/ml；对照组腹腔注射生理盐水10ml/kg。第一部分实验于腹腔注射内毒素或生理盐水后6h麻醉并解剖幼鼠。两部分实验均在造模完成后将幼鼠放回鼠笼与母鼠共同喂养。
2.3 肠组织的标本采集
在密闭玻璃容器中吸入七氟烷快速麻醉幼鼠后，将其固定于操作台，解剖，用1ml注射器迅速心脏采血，静置2小时，4℃下4000r/min离心15分钟，取上清液，-20℃冰箱中保存待检。距回盲部3cm向上取回肠组织7cm，4℃生理盐水冲洗肠管3遍，滤纸吸干肠组织表面水分后，将7cm回肠组织分为4段。上段1cm用于光镜下形态学观察，中上段2cm用于测量肠组织湿重和干重，中下段2cm用于制备肠组织匀浆，下段2cm用于RT-PCR检测肠组织HIF-1α mRNA的表达。
2.4 检测指标
2.4.1 计算肠组织湿/干重比（W/D）
电子称重计称量中上段2cm回肠组织并记录湿重，随后放入70℃恒温烘干箱烘干48h至重量不再发生变化，测量干重，计算湿/干重比。
2.4.2 肠组织形态学观察
将上段1cm回肠组织放入4%多聚甲醛中保存待检。石蜡包埋后制作4μm病理切片，行HE染色。400倍光镜下观察回肠组织粘膜上皮细胞形态学的改变。
2.4.3 ELISA法测定肠组织中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln、二胺氧化酶（DAO）及血清DAO的含量
中下段2cm回肠组织称重后制备组织匀浆，4℃下3000r/min离心15分钟，取上清液，置于-20℃冰箱保存待检。TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln和DAO的检测严格按照ELISA试剂盒（R&D公司，美国）说明书进行。
2.4.4 RT-PCR法测定肠组织HIF-1α mRNA的表达
将下段2cm回肠组织经DEPC水冲净后滤纸吸干，迅速经液氮冷却后放入冻存管中，置于-80℃冰箱保存待检。经肠组织总RNA的提取、逆转录、DNA扩增和琼脂糖凝胶电泳等步骤检测幼鼠肠组织HIF-1α mRNA的表达情况。
3．统计学处理
采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差( ± s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差异法（LSD-t），以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。结 果1.肉眼观察，腹腔注射LPS后，1小时内L组与P组幼鼠开始出现浑身抖动，呼吸急促。2~3小时左右出现周身发凉，精神萎靡，活动度下降，并且进食减少。6小时左右出现明显的倦怠乏力，几乎不活动也不进食，甚者口唇青紫。P组幼鼠症状相对较轻，C组幼鼠活动、进食等情况正常。C组、L组及P组的24h生存率分别为100%、69.2%和92.3%，幼鼠死亡主要发生在注射LPS后12~24小时期间。2.与C组比较，L组和P组肠组织湿/干重比均显著升高（P<0.05）；与L组比较，P组的这一比值显著降低（P<0.05）。差异均有统计学意义。3.HE染色光镜结果显示：C组回肠绒毛结构完整，上皮细胞排列整齐，形态正常；L组可见绒毛细胞水肿，炎性渗出，上皮细胞排列紊乱；P组绒毛水肿、炎性渗出较L组均明显减轻，上皮细胞排列较整齐。4.与C组比较，L组和P组肠组织TNF-α、IL-6、HIF-1α的含量均升高（P<0.05），而Gln的含量降低（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织Gln的含量较高（P<0.05），而余各指标的含量均较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。5.与C组比较，L组和P组肠组织DAO含量均显著降低，而血清DAO含量升高（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织DAO含量较高，而血清DAO含量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。6.与C组比较，L组和P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量均升高（P<0.05）；与L组相比，P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。结 论 盐酸戊乙奎醚预先给药后幼鼠肠组织水肿明显减轻，炎症因子表达显著降低。其作用机制可能是盐酸戊乙奎醚通过下调HIF-1α的表达及维持Gln的含量，减轻肠道炎症反应，保护肠粘膜屏障功能，从而起到肠保护作用。关键词：盐酸戊乙奎醚；内毒素；肠损伤；缺氧诱导因子-1α；谷氨酰胺，二胺氧化酶第1章 前 言败血症是新生儿重症监护室发病和死亡的主要原因[1]。革兰氏阴性菌释放的内毒素被认为是触发炎症反应的始动因素[2]。内毒素可诱发各种炎症介质的释放，这与败血症、全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征衰竭（MODS）的发生发展是密切相关的。同时，胃肠道也是多种临床病理情况如败血症、休克和缺血/再灌注损伤时常易损及并最终导致功能障碍的靶器官[3-5]。内毒素是刺激胃肠道产生炎症反应的来源之一，可以破坏肠粘膜屏障，进一步导致内毒素的移位[6]。由于医疗技术的不断提高，低体重早产儿的存活率也随之上升。但是新生儿特别是早产儿的肠道粘膜功能尚未发育成熟，这就造成了小儿坏死性小肠结肠炎的发病率也越来越高，导致肠组织出现炎症反应、缺血和坏死。因此保护新生儿肠组织结构和生理功能则尤为重要。缺氧是内毒素血症等多种疾病的临床特征。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）被证实是细胞对缺血缺氧环境做出适应反应的主要调控因子[7]。HIF-1，由氧敏感性α亚基与核定位性β亚基组成，是一个主要的转录因子和典型的氧依赖性基因转录的调节因子。HIF-1α亚基在多种细胞内广泛表达，但在常氧状态下该蛋白被脯氨酸羟化酶（PHD）羟基化后被泛素-蛋白酶体所降解。缺氧条件下，PHD活性受到抑制，HIF-1α表达逐渐增多，并且活性逐渐升高，与HIF-1β亚基结合形成有活性的HIF-1，进入细胞核后可与多种基因启动子或增强子上的缺氧反应元件（HREs）结合而启动相关基因转录[8]。有大量研究发现，HIF-1α能够通过激活其下游的相关基因促进炎症因子的大量释放，从而加重内毒素血症或缺血/再灌注时的组织损伤[9-11]。谷氨酰胺(Glutamine，Gln)作为人体内含量最为丰富的氨基酸，是肠上皮细胞、淋巴细胞等快速分裂细胞重要的能量来源。Gln为机体提供必要的氮源，同时也是核酸生物合成的前体物质，能够促进细胞蛋白质的合成而抑制蛋白质的降解，有利于细胞的增殖与分化。血液中Gln近13%都被人体肠道摄取利用[12]。大量关于Gln的研究证实肠内或肠外营养中使用Gln，能够维持肠粘膜紧密连接的结构和功能，降低手术、创伤、烧伤及炎症性肠病时肠粘膜的通透性，阻止细菌及内毒素的移位和肠上皮细胞凋亡，对于保护肠粘膜结构和功能的完整性具有重要意义[13-18]。过去的几十年里，莨菪碱类药物被广泛应用于脓毒性休克的治疗并且收到了良好的效果。该类药物可以解除小血管痉挛，改善微循环。除了抗胆碱能作用外,还可以抑制生物膜脂质过氧化，降低败血症患者细胞因子和氧自由基的产生，也被证明能够抑制粒细胞和血小板的聚集[19]。但传统的抗胆碱药物都具有加快心率的副作用。盐酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride，PHC）是我国军事医学科学院药理毒理研究所自主研发的新型抗胆碱药，其特别之处在于该药对M受体具有选择性，主要作用于M1和M3受体，此类受体多存在于内脏平滑肌和腺体，因而对患者的心率没有影响。盐酸戊乙奎醚因显著改善休克患者微循环、减轻内脏器官的损伤和保护细胞，被认为是目前纠正脓毒性休克微循环痉挛最理想的血管活性药物[20]。有研究发现盐酸戊乙奎醚能缓解豚鼠离体回肠、结肠的痉挛状态[21]，可减轻围体外循坏期大鼠肠粘膜屏障功能的损伤，减少炎症因子的释放，从而起到肠保护作用[22,23]。综上所述，本课题通过腹腔注射内毒素制备幼鼠肠损伤模型，研究盐酸戊乙奎醚预先给药对内毒素致新生大鼠肠损伤时的保护作用及对肠组织HIF-1α和Gln表达的影响，初步探讨其肠保护作用机制。5.总结本文对内毒素的结构、功能和在体内的转运、转归以及肠组织生理功能等方面做了概括性回顾。对败血症动物模型做了较为详细地介绍。最后对国内外一些针对内毒素血症时肠保护方面的研究在机制上做以分类总结。肠道对于人体的重要性已经不需赘述，虽然近几十年来针对内毒素性肠损伤不断有新的治疗措施出现，但其发病率和死亡率在重症患者中仍然很高。目前没有哪一种单一的药物和治疗措施能够在临床败血症的常规治疗中有效抑制炎症因子的异常释放。我们现在所得到的大量的数据都来自于动物试验，即便有些治疗措施在动物模型上有效，其仍然不能通过临床试验，更不能应用于临床。人体是一个复杂的有机体，任何病理情况的出现都会引起大量的细胞反应和分子间的相互作用。对于疾病的认识，并不是某一方面就能够解释清楚的。因此，为了更好地阐明内毒素性肠损伤的病理过程和发掘更有效的干预措施，仍需要大量科研工作者不懈的努力。