大鼠心肌缺血后适应（IPOC）和心肌TOLL样受体4（TLR）

中 文 摘 要

目的比较大鼠心肌缺血再灌注及心肌缺血预适应，心肌缺血后适应心肌中Toll样受体4 ( TLR4)的表达变化。 讨论心肌缺血后适应以及Toll like receppt 4(TLR4)对心肌缺血再灌注损伤的影响。 方法将48只Vistar大鼠随机等分为4组，假手术组(shame组):开胸暴露心脏，左冠状动脉前降支仅穿线不结扎； 心肌缺血组(ischemia/reperfusion ,I/R组):前降支血管先结扎造成心肌持续缺血30 分钟，后松开结扎线保持血管再通60分钟；心肌缺血预适应组（(Ischemic preconditioning, IPC ,IPC组）：前降支血管先进行5分钟结扎，5分钟开通即再灌注血管，循环3次，然后再结扎闭合前降支血管造成心肌缺血30分钟，后松开结扎线保持血管再通60分钟； 心肌缺血后适应组（IPOC组）:前降支血管结扎造成心肌缺血30分钟后，首先进行3次，5分钟/5分钟的短暂的缺血/再灌注循环，然后持续灌注60分钟。大鼠模型制备完成后，取出实验大鼠心脏，用0.1%氯化硝基四氮唑兰即0.1%NBT染色，用来检测各组大鼠左心室心肌梗死面积；Envision免疫组化法检测各组心肌TLR4的表达水平。 结果(1)与I/R组比较，IPC组、IPOC组大鼠左心室心肌梗死面积减小（P 〈 0.05）；和IPC组相比，缺血后适应组降低大鼠左心室心肌梗死面积和IPC组无显著性差异（P0.05）。 (2)TLR4表达水平:与Shame组比较，其余3组TLR4表达显著增加； 与I/R组比较，IPC组、IPOC组大鼠TLR4表达显著下降（P 〈 0.05）； 与IPC组比较，IPOC组TLR4表达与IPC组无明显差异（P 〉 0.05）。 结论IPOC可能对缺血再灌注损伤心肌有保护作用，其保护缺血再灌注损伤心肌的作用可能与IPC具有相同的效果； 抑制TLR4的表达可能是其保护I/R心肌的一个重要途径。
关键词心肌缺血再灌注损伤,缺血后适应,Toll样受体4
ABSTRACT
Objective Comparison of myocardial ischemia and reperfusion and preconditioning after myocardial adaptation of Toll-like receptor4(TLR4) expression change. To invest
igate the roles of ischemic postconditioning and Toll like receptor 4 in myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods 48 Vistar rats were randomly divided into four groups, shame operation group(shame): thoracotomy esposed 30 min, without ligation of anterior descending branch of left coronary artery; myocardial ischemia reperfusion group (IR): anterior descending branch of left coronary artery was ligated for 30 min, reperfusion for 60 min. Preconditioning(IPC)group: first given the anterior descending branch of left coronary artery to5min/5min of ischemia/reperfusion cycle three times, then the anterior descending branch of left coronary artery was ligated for 30 min reperfusion for 60 min. ischemic postconditioning(IPOC) group: after ligation of anterior descending branch of left coronary artery for30 min, immediately given 5 min/5min of ischemia/reperfusion cycle three times, reperfusion for 60 min. The rats were sacrificedand removed the hart at the end of experiment , left ventricular infarction area was measured by into blue tetrazolium(NBT) staining, the expression of TLR4 was detected using Envision. Results (1)compared with I/R group, the IPC group the IPOC group rats left ventricular infarction area decreased(P < 0.05);compared with the IPC group, IPOC reduce rats left ventricular infarction ares and IPC group no significant difference(P > 0.05) .(2)The TLR4 expression level: compared with I/R group, the IPCgroup,IOPC group TLR4 expression of rats decreased significantly (P < 0.05);compared with the IPC group,IPOC group of TLR4 expression has no obvious difference(P > 0.05). Conclusion IPOC reduce extent of myocardial I/R and reducing myocardial infarction area and IPC has the same effect, inhibition of the expression of TLR4 might be its protection is an important way of myocardial I/R.
Keywords myocardial ischemia, reperfusion injury, Ischemic postconditioning,
Toll-like receptor 4
急性心血管疾病在我国发病率逐年攀升，这不仅使心肌缺血再灌注治疗在临床应用增加（心肌缺血再灌注治疗包括溶栓、经皮穿刺冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术(CABG)等）。 同时也增加了心肌缺血再灌注损伤的发生。这是继急性心肌梗死后，向临床医生提出的又一新的挑战。 心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，。MIRI）是在心肌缺血的急性心血管事件基础上，重新恢复冠脉血流之后，原缺血心肌组织损伤反而加重,甚至发生不可逆损伤的现象，比如心肌细胞加速死亡、心脏血流动力学持续障碍、出现再灌注心律失常，血管内皮功能障碍等[ 1]。在面对心肌缺血再灌注损伤的临床难题上，国内外已经进行了大量的动物实验研究及探索，并且已经找到了能够减轻这种再灌注损伤的方法。研究证明心肌缺血预适应(Ischemic preconditioning, IPC)，心肌缺血后适应(Ischemic postconditioning，IPOC)以及优化TOLL样受体4（Toll-like receptor-4, TLR4）等方法均可保护缺血再灌注心肌组织，减轻MIRI[2-4]。近期大量研究证明TOLL样受体4参与心肌缺血再灌注损伤，并且通过抑制TLR4受体，干预TLR4传导通路，可以对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。如Oyama 等,建立小鼠心肌I /R 模型， 研究发现TLR4 缺陷型小鼠因为TLR 4 信号传导的缺失，在小鼠心肌缺血再灌注1小时后，和假手术组比较，可以减小小鼠心肌缺血再灌注过程的心肌梗死面积，并且可减轻小鼠心肌缺血再灌注过程与心肌损伤加重有关的炎症反应， 其中包括中性粒细胞聚集、氧化应激、补体活化沉积等[5]。另有研究表明，可溶性的TLR4抑制剂能够防止野生型大鼠缺血再灌注损伤，减少中性粒细胞浸润、减少活性氧的产生，减少细胞凋亡， 减轻心肌收缩功能障碍，减少心肌梗死面积[6]。目前国内外有研究表明将抑制TLR4及干预其通路与IPC相结合通过药物预处理缺血再灌注心肌，可以达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的。 2011年景桂霞[7]等在SD大鼠心肌缺血再灌注模型研究发现：与假手术组（Shame）组比较， IR组和七氟醚预处理（sP）组TLR4、核因子（Nuclear factor Kappa, NF-KB）和肿瘤坏死因子（TNF-a）的蛋白表达上调(P〈0．05)； 与IR组比较，sP组TLR4、NF-KB和TNF-a的蛋白表达下调(P〈0．05)。 病理学结果显示：SP组心肌细胞损伤较IR组减轻。 提示七氟醚预处理可通过抑制TLR4表达上调，降低炎性反应，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。 但是在临床工作中我们不可能针对患者还未发生病变的某支血管进行反复的缺血及再灌注，以达到对将来可能出现病变的心肌进行保护的目的，这不符合医学伦理学。因此，预适应仍处于动物实验阶段，这也说明了预适应的局限性。为了弥补这一缺陷， 2003年赵等提出了“心肌缺血后适应（Ischemic postconditioning， IPOC）是心肌发生缺血后立刻对相应病变冠状动脉进行短暂的、多次的开通及再闭的过程，最后持续恢复冠状动脉血流” [8]。大量动物研究表明 ，心肌缺血后适应即对缺血心肌首先进行多次短暂的血管再通及缺血，也能达到“减少梗死面积，减缓心肌细胞凋亡，改善血管内皮功能，减轻缺血心肌水肿” [ 9-14 ]的目的。说明缺血后适应在保护缺血心肌保护作用上与预适应有同样的效果。心肌缺血后适应的操作方式预示着其临床推广的可能性较大。但是对于没有进行冠脉造影条件的患者，及医院，IPOC的治疗仍然存在很大的局限性。这要求我们能够进一步探索，研究新的，方便，有效，适合广泛推广临床的后适应治疗方法。假设目前存在某种药物，可以替代后适应直接对冠脉的开通和再闭，作为接受溶栓，介入等血管再通治疗的补救治疗， 那将大幅度提高缺血再灌注损伤的临床治疗价值。 本文就此设想，将进一步研究IPOC在心肌缺血再灌注损伤中的作用，研究心肌缺血再灌注损伤(I/R)，心肌缺血预适应(IPC)， 心肌缺血后适应(IPOC)中TLR4的表达。 探讨IPOC与TLR4在心肌缺血再灌注损伤发挥其保护作用过程中的相关性，设想两种方法是否存在保护缺血心肌中存在相同或相近的机制，提出是否可能将IPOC与优化TLR4相结合，通过药物后适应治疗心肌缺血再灌注损伤。 为实验室寻找缺血再灌注损伤治疗方法上提供新的研究方向。
室心肌组织中TLR4的表达明显升高（P 〈 0.05）； 和I/R组比较，IPC、IPOC两组IOD值显著降低，即TLR4的表达显著降低，且具有统计学意义（P 〈 0.05）； IPC和IPOC组两组之 间IOD值无明显差异，即TLR4表达无明显差异（P 〉 0.05）。详见表2，图3-4。与以往研究 结果相符。
该实验结果说明TLR4在缺血再灌注损伤心肌中的表达与IPOC具有一定的相关性。 大量的动物实验研究表明，抑制TLR4或者干预TLR4信号通路可以治疗缺血再灌注损伤。成为目前在缺血再灌注损伤研究中的新方向。 然而，TLR4作为免疫系统中的重要受体，在人体内的作用非常复杂。 到目前为止大量的临床研究仍然不能表明,通过抑制免疫反应对治疗非免疫性心血管疾病有良好的效果。 免疫系统的激活存在两方面效应，一方面完整的免疫系统在机体发挥着重要的保护及防御作用,但是长时间的免疫激活也会引起”不利”的反应，从而导致致疾病的发生、发展。当前面临的主要挑战就是，在尽可能的限制先天免疫反应的不利因素的同时，最大化的保持其足够、适当的先天免疫防御机制。 当前研究探索能否将后适应与优化TLR信号通路完美结合，去探索更加安全、有效的治疗缺血再灌注损伤的方法，有待进一步研究。
缺血后适应对缺血心肌的保护作用，与物种，个体特质，组织缺血时间以及后适应治疗方案的选择有很大关系。所以我们在以后的动物实验中应该考虑到物种之间的差别，个体之间的差异，缺血时间的长短，并且寻找最佳的缺血后适应治疗方案，为进一步的临床试验提供参考。由于临床试验的缺乏，目前没有足够的信息量来明确一些因素（包括CAD的风险因素,基础疾病，发病时间，药物治疗,性别和年龄等）对缺血后处理治疗效果上有怎样的影响。 目前缺血后适应对于急性心梗患者的近期，远期预后是否有所改善，合并其它基础疾病，以及有并发症的患者治疗是否有效，以及在发生急性心血管事件发生后多大的时间窗内给于后适应可以达到缺血心肌的保护作用，后适应短暂的血管再通及闭合最佳需要多长时间，国内外 有10s-5min不等，给几次这样短暂缺血/再灌注的循环对保护缺血心肌效果最佳，目前文献 大多数给3次短暂缺血/再灌注循环。当前大量关于后适应的研究局限于实验动物，要真正的 过渡到临床还需要克服相当大的困难。这些都是临床治疗中面对的问题，也为后续有关缺血后适应的研究提出了要求和方向。要求我们寻找出更加有效，安全，严谨，方便的后适应治疗方法。
本实验通过对48只Vistar大鼠进行心肌缺血再灌注损伤研究，结果发现缺血预适应与后
适应均可以减少缺血再灌注损伤心肌梗死面积， 两组之间减少心肌梗死面积程度无明显差异。 缺血预适应与后适应中TLR4表达比缺血组减少，两组之间TLR4表达无明显差异。 说明缺血预适应与缺血后适应可保护缺血再灌注损伤心肌。 结合以往的研究结果，缺血后适应与TLR4在缺血再灌注损伤中可能存在相关性。 将来的研究中是否可能将缺血后适应与抑制TLR或干预TLR通路结合，找出两种治疗缺血再灌注损伤路径的契合点，研究出适合临床推广的药物后适应治疗途径。