长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞影响及其氧化损伤机制研究

摘要
目的:
分析长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞的影响，为筛选低浓度砷暴露的早期损伤指标提供依据；
检测长期低浓度砷暴露对人群DNA氧化损伤的影响；
探讨饮水型砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害的关联性，为砷的毒作用机制研究提供一定的依据。
方法:
　　　选择相邻经济发展均衡的山西大同地砷病区 ( 水砷含量为14.41～90.34 μg/L ) 和非地砷病区（水砷含量为0～0.87 μg/L）2个自然村，饮水年限20年以上本地居民，无传染性、遗传性等疾病，无放射线和理化致病因素接触史156人为调查对象。用全自动血细胞分析仪分析测定人群血细胞参数的变化。原子荧光光谱法测定研究对象体内尿砷水平，ELISA试剂盒测定其血清8-OHdG的含量。由两名经过培训的皮肤科医生确定研究对象皮肤损害的程度。按照皮肤损害程度的不同分为无皮肤损害组（即正常组）、轻度皮肤损害组、中度皮肤损害组和重度皮肤损害组。
结果:
长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞参数的影响
1.1 白细胞各项指标：与对照组比较，砷暴露组WBC、GRA、GRA%、LYM和LYM%均增加，其中LYM和LYM%的增加有统计学意义（P均<0.05）；1.2 红细胞各项指标：与对照组相比，砷暴露组RBC、HGB、MCH、MCHC和RDW升高， MCV下降，差异均有统计学意义（P均<0.05）；1.3 血小板各项指标：与对照组相比，砷暴露组PLT、MPV和PCT下降，PDW升高，差异均有统计学意义（P均<0.05）。长期低浓度砷暴露对人群DNA氧化损伤的影响2.1 与对照组相比，砷暴露组的水砷、尿砷和血清8-OHdG含量均增加，且差异均有统计学意义（P <0.05）；2.2 多元线性回归分析显示，血清8-OHdG的含量与水砷、年龄和尿砷呈正相关；2.3 免疫荧光检测显示，砷暴露组人群白细胞中的8-OHdG和8-NitroG含量均增加，且8-OHdG和8-NitroG的表达基本一致。3. 长期低浓度砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害的关联性3.1 不同皮损组的尿砷和血清8-OHdG分布差异均有统计学意义（P <0.05）；与正常组相比，轻度、中度和重度皮损组血清8-OHdG含量均增加（P<0.05）；与轻度和中度皮损组相比，重度皮损组的尿砷浓度和血清8-OHdG含量均升高（P<0.05）；3.2 Logistic回归分析显示，年龄和8-OHdG是砷暴露人群皮肤损害的主要危险因素 ( OR=9.874, P<0.05; OR=6.084, P<0.05 )。结论: 1. 长期低浓度砷暴露能引起人群外周血血细胞参数的改变。白细胞和红细胞增加，血红蛋白浓度升高，血小板数目明显减少；血小板和红细胞体积异质性增加。2. 砷暴露可加剧人群DNA的氧化损伤；3. 长期低浓度砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害之间存在一定的关联性。　　　关键词:低浓度砷暴露；流行病学；外周血血细胞；DNA氧化损伤；皮肤损害；8-OHdG研究背景　　　砷是地壳的组成成分之一，多以化合物的形式存在。常通过天然含砷岩层自然风化溶解和人类活动（金属矿物的开采冶炼、高砷煤燃烧、砷化合物用于玻璃、颜料、农药、药物、纸张、木材、制革、纺织、化肥生产/制造等）污染环境。尤其是近年来大量开发利用地下水源，地域性水体砷含量过高引起的慢性砷中毒，已成为了国际社会面临的最为严峻的公共卫生问题之一。　　　饮水型砷中毒是长期饮用高砷水引起的一种慢性砷中毒，也称为地方性砷中毒（Endemic arsenism），临床主要表现为皮肤色素异常、掌趾过度角化，皮肤、肺、膀胱等肿瘤高发，且与高血压、心脑血管病、周围血管病、糖尿病等慢性疾病的发病率升高有关[1]。我国最早20世纪50年代在台湾西南沿海地区发现饮水型砷中毒病区，80年代至今，先后在新疆、内蒙古、山西、宁夏、青海、吉林、黑龙江等12省区发现饮水型地砷病区[2,3]。由此可见，慢性砷中毒正在对人类健康构成严重的威胁，给社会带来巨大的疾病和经济负担。 因而，寻找慢性砷中毒的早期毒作用靶点,探讨砷的毒作用机制显得尤为重要。研究现状及选题依据　　　摄入体内的砷首先进入血液，其中95％～99％的砷迅速与红细胞血红蛋白结合，再随血流分布和贮存于全身各组织器官，其余的与血浆蛋白结合[4,5]。流行病学调查显示，长期砷暴露人群会产生贫血[6]。动物实验表明，经饮用水砷染毒后大鼠全血RBC计数、红细胞压积及血红蛋白含量下降，WBC计数增加[7]。Ferzand等的研究也证实砷染毒会引起机体血液系统的紊乱[8]。这就提示砷进入人体最早作用并产生毒效应的可能是血液系统。因此，有必要对砷暴露人群血液系统的相关指标进行研究。　　　砷中毒作用机制尚不明确，目前认为砷进入细胞后可引起细胞内超氧阴离子自由基（﹒O2-）、羟自由基（﹒OH）和过氧化氢（H2O2）等活性氧族（ROS）增多，造成DNA的氧化损伤。近年来的研究表明，砷通过激活细胞质内一氧化氮合酶（NOS）活性，促使过多的一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴离子（ONOO-）等活性氮族（RNS）生成，导致组织细胞损伤[9]。　　　8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)是活性氧自由基攻击DNA分子中的鸟嘌呤第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，它是活性氧基团引起的DNA氧化损伤修饰产物之一。在多种与氧化损伤关系密切的疾病中，均可见8-OHdG水平增高[10]。李昕等发现高砷暴露可引起尿8-OHdG水平增高，且存在明显的剂量-效应关系[11]；徐文超等发现长期低砷暴露可引起尿8-OHdG水平增高，且与皮肤损伤程度呈明显正相关[12]；但砷暴露对血清8-OHdG的影响研究还少见报道。8-硝基鸟嘌呤（8-Nitroguanine，8-NitroG）是由活性氮族、过氧化亚硝酸阴离子或二氧化氮攻击核酸的产物，可以造成哺乳动物细胞的突变，进一步导致癌变[13]。但国内对此方面的研究极少见报道。研究课题及意义　　　本研究拟进行流行病学调查采集血液、尿液及日常饮用水样本，检测环境砷及内暴露水平；检测低浓度砷对人群外周血血细胞的一般毒性(血细胞计数仪测外周血血细胞参数)；进一步研究其对人群的氧化损伤：检测白细胞中8-OHdG和8-NitroG的分布及表达水平，全面反映低砷对机体整体水平、细胞水平和分子水平的损伤。以期寻找慢性砷中毒的早期毒作用靶点，促进慢性砷中毒的早期预防和有效诊疗，同时为砷的毒作用机制研究开辟一个新的思路。第一部分 低浓度饮水型砷暴露对人群外周血血细胞参数的影响 材料与方法1 研究对象和分组　　　选择相邻经济发展均衡的山西大同地砷病区和非地砷病区2个自然村，饮水年限20年以上本地居民，无传染性、遗传性等疾病，无放射线和理化致病因素接触史156人为调查对象。其中地砷病区85名为病例组，年龄（59.31±12.65）岁，水砷含量为14.41～90.34 μg/L，检测时尚未改水；非地砷病区71名为对照组，年龄（57.96±7.79）岁，水砷含量为0～0.87 μg/L。平衡病例组和对照组年龄、性别、吸烟、饮酒等因素的影响。2 主要试剂与仪器2.1 主要试剂主要试剂 生产厂家 2.2 主要仪器、器材主要仪器、器材 生产厂家一次性真空EDTA·2Na抗凝采血管 湖南省浏阳市医用仪具厂一次性真空肝素抗凝采血管 湖南省浏阳市医用仪具厂全自动血细胞分析仪 北京科海同业科技发展有限公司 -80℃超低温冰箱 美国Thermo Forma公司3 血样采集及检测3.1 血样采集　　　选择肘正中静脉，先扎止血带，选择粗且直，弹性好的静脉，松止血带，先碘酒消毒，1分钟后酒精消毒，再扎止血带，以采血针斜面向上，45度角进针，针尖进入血管就平行进针，待针进入血管，即可抽血。将血抽至2ml一次性真空EDTA·2Na抗凝采血管中。3.2 血样检测　　　用全自动血细胞分析仪及相关原装配套试剂盒定标液，分析测定白细胞（WBC）、淋巴细胞绝对值（LYM）、淋巴细胞百分比（LYM%）、中性粒细胞绝对值（GRA）、中性粒细胞百分比（GRA%）、单核细胞绝对值（MON）、单核细胞百分比（MON%）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞比积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）、血小板（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）和血小板分布宽度（PDW）18个指标的变化情况。血细胞参数的检测严格按照血细胞分析仪的说明书进行。4 统计学分析　　　所有数据都录入Excel工作表中，然后用SPSS16.0统计分析软件进行分析，计量资料用表示。对所有数据进行正态性和方差齐性检验：服从正态分布，方差齐的，用两独立样本的t检验；服从正态分布，方差不齐的，用两独立样本的t' 检验。所有检验均采用双侧检验，检验水准ɑ=0.05。结论 砷暴露人群的血清8-OHdG含量明显增加；血清8-OHdG的含量与水砷、年龄和尿砷呈正相关；免疫荧光检测显示，砷暴露组人群白细胞中的8-OHdG和8-NitroG含量均增加，且8-OHdG和8-NitroG的表达基本一致。 砷暴露可加剧人群DNA的氧化损伤。 不同皮肤损害程度的砷暴露者DNA氧化损伤的标志物8-OHdG水平有显著差异。 血清8-OHdG可作为DNA氧化损伤的生物学标志物，饮水型砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害之间存在一定的关联性。