日本血吸虫重组SjTsp2/Sj29kDa表膜蛋白疫苗免疫效应的研究

1 前言

　　　 血吸虫病是由血吸虫引起的一种慢性寄生虫病。据世界卫生组织(WHO)2014年2月第115号报道，截止2012年，全球至少有2.49亿人需要得到血吸虫病治疗，得到血吸虫病治疗的报告人数为4210万[1]。我国尚有454个血吸虫病流行县(市、区)，共有流行村30701个，估计患者28万余例，全国现有钉螺面积372 664．10 hm2，其中新发现钉螺面积1 163．87 hm2 [2]。目前，控制日本血吸虫病的措施主要还是以灭螺和药物化疗为主，但仍然存在着诸多问题，比如：防治成本高、效果欠佳、环境污染、重复感染、畜类感染控制困难、血吸虫虫株的抗药性出现的潜在威胁等。在以往的流行病学调查中发现感染血吸虫后的人群体内可以产生抵抗力，人体的免疫系统起到一定的保护作用，由此说明血吸虫在宿主体内引起了一定的保护性免疫反应，而血吸虫自身生活史的特点如宿主体内发育不繁殖，这为日后研究血吸虫病疫苗提供了很好的思路。
　　　 WHO 专家 Bergquist 等指出，预防性疫苗单独使用或与化疗药物联用，为血吸虫病的可持续控制提供了一条理想途径[3]。而未来血吸虫病防治策略将会是：以疫苗接种诱导的具有长效的免疫预防作用补充控制传播的短效不足[4]。血吸虫病疫苗的研究已经半个多世纪了，随着生物学和免疫学技术的不断发展，疫苗的研究也经历了很多的变革，从减毒或灭活疫苗到目前的蛋白疫苗、基因工程疫苗等，科学家们一直在不懈努力。在这个过程中，研究人员运用分子生物学和免疫学等方法对血吸虫病疫苗候选分子进行了大量实验研究，确定了一些疫苗候选分子，如谷胱甘肽S转移酶、磷酸丙糖异构酶、23kDa膜蛋白等[5]。但是以往研究表明，以小鼠作为模型，评价对谷胱甘肽S转移酶、磷酸丙糖异构酶等抗原免疫保护性效果仍不够理想。余光清等在动物实验模型中，分别用Sj26和rSj26 GST单独免疫小鼠，得减虫率28.0%和25.5%以及减卵率20.6%和33.0%[6]。所以寻找新的高效疫苗候选分子仍然是今后疫苗研究的主要任务。
　　　血吸虫虫体与宿主免疫系统直接接触相互作用，体被是虫体的最外层结构，覆盖于整个虫体的表面。其体被参与一系列的生理过程：营养吸收、免疫逃避、排泄代谢产物、调节渗透压、感觉及信号转导等[6]。表膜蛋白更易刺激机体产生相对应的免疫反应，提示位于血吸虫体被的表膜蛋白作为疫苗和药物靶点的重要性，故认为表膜相关抗原研究在血吸虫病疫苗发展和免疫诊断方面起重要作用[8]。Braschi 等根据可溶性的不同将体被蛋白分为胞浆内蛋白、细胞骨架蛋白和膜相关蛋白。利用链亲和素亲和层析的方法，发现位于体被表面的蛋白仅有 9 种[9]。依此可以利用蛋白组学和生物信息学技术筛选出更好的血吸虫病疫苗候选分子，针对血吸虫表膜抗原分子，国内外不少专家进行很多研究。Cardoso等2006年发现在被血吸虫感染的人群体内，检测到抗Sm29的抗体亚型IgG1和IgG3的水平很高，之后通过RT-PCR技术和生物信息学等手段确定了Sm29在曼氏血吸虫体内的一种跨膜分子，且能够较高表达[10]。接着2008年Cardoso等学者们通过共聚焦显微镜确定 Sm29 蛋白为体表分子，通过动物模型实验，得到重组Sm29kDa蛋白51％减虫率、60％减卵率和 50％减肉芽肿的结果[11]。四跨膜蛋白超家族（TM4SF）广泛表达于多种组织、细胞，它属于小分子量的糖蛋白，大约有20多个成员[12]。Tran等通过信号序列捕获技术发现了两个TSP 家族成员— SmTsp1和 SmTsp2，经免疫定位实验得出，TSP表达于血吸虫体被，研究人员将假定的耐受者和感染者的血清进行ELISA检测，得知耐受者的血清中抗TSP-2的抗体IgG1和IgG3水平，在动物实验中得出SmTSP2 融合蛋白免疫小鼠后，取得了减虫率57%、肝脏减卵率64%和粪减卵率69%的结果[13]。因此，TSP2 蛋白被认为是潜在的保护性抗原。Yuan等研究人员扩增了一段 SjTSP2 膜外大环区，亚克隆至pET32a 质粒中表达了Trx-TSP2 融合蛋白，也得出 56%的减虫率、53%的肝脏减卵率和 52%的粪减卵率结果[14]。
　　　为了筛选出更好地疫苗候选抗原分子，探讨不同疫苗形式对免疫效果的影响。本研究选取日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团蛋白（SjTsp2）与Sj29kDa表膜蛋白胞外区（Sj29），通过基因SOEing PCR技术，用疏水性多肽（Gly4）3作为连接肽将二者进行连接，构建的融合基因pet32a/SjTsp2/Sj29kDa表达质粒[6]，在此基础上，本课题通过诱导表达，大量制备重组表膜蛋白，研究其对小鼠抗血吸虫病的保护性免疫效果。 血吸虫病是危害非常严重的一种人兽共患寄生虫病。近年来, 在我国南方 12 个省的 449 个血吸虫流行县中, 仍有 90 个县的疫情尚未得到控制，将近 50 万人转化为慢性血吸虫病人[15]。人类对人体血吸虫均无先天性免疫，宿主感染血吸虫后对再感染可产生不同程度的抵抗力，对再次入侵的童虫具有一定的杀伤作用，但对原发感染的成虫是不起作用的。现今用于血吸虫病治疗的药物效果较好的仅有吡喹酮，然而吡喹酮的作用机理是直接杀血吸虫，对于日本血吸虫虫卵各期的发育却没有明显的影响[16]。因此，有效的血吸虫病疫苗的研究是目前有效防治血吸虫病重要举措之一。
　　　血吸虫是一种多细胞生物，且生活史比较复杂，不同的发育阶段处于不同的环境条件下，因此它的生理、生化和相应的组织结构也随虫期的变化而不停地调整，不同虫期的新陈代谢产物也都随之变化，其中有些代谢产物在不同的虫期中普遍存在，但有些代谢产物具有种、株甚至虫期的特异性[17]。这也决定了血吸虫病疫苗研究的难度。日本血吸虫疫苗研究已有80多年的历史，大体经历了死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗这几个研究阶段[18]。随着近年来，有许多学者在血吸虫分子疫苗领域做了大量的研究，并取得了一些成果。为了更好的提高疫苗的效果，研究人员采取了很多创新手段，构建重组多价疫苗是其中的一种方法。单一基因重组的DNA疫苗激发宿主免疫的不完全性等因素影响，单价DNA疫苗的保护效果仍不尽人意。与单一的疫苗相比，重组多价疫苗一般能获得较好的免疫效果，从而达到增强宿主抗血吸虫感染抑制血吸虫病病程进展的效果[19]。王素娟等[20]应用 PCR 技术构建重组抗原rSj06868，获得31.63%的减虫率和55.63%的肝脏减卵率；刘秉春等[21]用日本血吸虫DNA疫苗VR1012-SjGST-32与重组蛋白疫苗rSjGST-32联合免疫小鼠，获得42.3%的减虫率。郭凡吉等[22]利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol畜II类、鼠源（H2-d）II细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段，并进行拼接，经表达后免疫小鼠，获得了39.7%的减虫率和64.9%的肝脏减卵率；朱路[23]运用RT-PCR和重组PCR技术构建三价DNA疫苗pVIVO2/SjFABP/Sj26.SjGAPDH，在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率为58.6%和59.8%。以上血吸虫分子疫苗的研究中运用不同的方法构建了各种重组抗原，均得到了一定的免疫保护效果。
对于血吸虫自身来说，它本身有着特殊的结构特征。血吸虫体被直接暴露于宿主血液及免疫系统下，参与虫体的营养代谢、排泄、免疫逃逸和调节、渗透调节、感觉和信号转导，成为疫苗研发的热点之一[6]。血吸虫虫体的表面抗原和排泄-分泌抗原可直接接触或致敏宿主的免疫细胞，因此虫体的表面抗原尝试免疫效应攻击的把抗原，而排泄-分泌抗原常具有酶的性质，进入血液成为循环抗原，可诱发宿主的保护性免疫，或形成抗原抗体复合物，引起免疫病理变化[17]。已经有研究发现了一部分存在于体被表面的蛋白以及通过体被转运的蛋白。主要包括两种蛋白：胞内蛋白和膜结合蛋白，后者位于血吸虫体被表面[24-25]。近些年有学者通过免疫学技术等筛选出血吸虫虫体的表膜蛋白，如：Mr 23 000膜蛋白、Mr 29 000 膜蛋白、Mr 20 000 膜蛋白、Mr 7 392 膜蛋白、Mr 4 463 膜蛋白、Mr 921 膜蛋白、Mr 16 000 表面膜蛋白等[26]。针对这些膜蛋白，科学家们做了很多研究，任建功等制备SjC23DNA疫苗和蛋白疫苗分别免疫小鼠，获得减虫率为26.9%和15.2%以及减卵率22.2%和12.2%[27]。陈红等应用生物素亲和技术发现血吸虫体表存在rSj29蛋白，通过克隆表达后评估该蛋白的免疫保护效果，最终得到减虫率23.15%、肝脏减卵率18.6%和粪减卵率27..38%[28]。最新研究，有学者通过免疫蛋白组学和生物信息学技术，首次发现了30个高免疫反应的表膜蛋白和10个AUC值远远大于0.90的抗原，尤其指出STIP1具有很高的抗原性和免疫原性，这为下一阶段研究抗寄生虫药物和血吸虫疫苗提供了潜在的目标[29]。
3 血吸虫病疫苗研究面临的问题与展望

长期以来，对于日本血吸虫病疫苗的研究，虽然人们已经发现了许多分子作为抗原候选分子，具有部分免疫保护效果，但至今仍未获得一种能够有效防治日本血吸虫病的疫苗，所以寻找可产生长期效用的血吸虫病疫苗，一直是众多学者们奋斗的目标。为了推进血吸虫病疫苗研究工作，世界卫生组织热带病研究培训特别规划署（WHO Special Programme for Research an Training in Tropical Diseases,TDR）将血吸虫病疫苗研制置于血吸虫病防治研究的优先地位。我国也已经将日本血吸虫病基因工程疫苗项目已纳入国家高技术计划范畴。
　　　但，目前在血吸虫病疫苗研究领域中仍然存在问题：
　　　⑴ 抗原分子免疫保护力不高。科学家们曾以小鼠为模型对6 种血吸虫病疫苗候选分子进行评估，结果都没有达到 40%或者更高的预期保护力[48]，所以在疫苗的研究中，如何提高疫苗的免疫保护效果是关键点之一。
　　　⑵免疫逃避现象。血吸虫免疫逃避机制有可能降低疫苗诱导的保护力水平或宿主产生的保护性免疫应答。日本血吸虫虫体表面存在许多抗原分子，它往往会结合宿主自身抗原，逃避宿主免疫系统的识别。另外，疫苗免疫保护力的保持力需要时间和大量实验来证明。
　　　⑶实验动物与人的免疫系统之间的差异。截至目前血吸虫病疫苗研究处于动物模型实验的阶段，实验动物产生的免疫机制与人体差异很大，而疫苗本身对于动物的不良反应还尚不明确，所以导致实验动物得出的结论很难完全适用于人体。
血吸虫病疫苗的研究任重而道远，可能需要几代人的努力去逐步实现，过程很艰难，但是科学家们会竭尽全力。近几年，科学家们有了一些新的思路：(1) 对新型疫苗候选抗原的筛选。Hu Wei等[49]针对日本血吸虫各种生活阶段的全基因组序列进行分析，获得了 43707 个表达序列标签（ESTs），共 13131 个基因种类。Liu Feng 等[50]通过比较蛋白质组学和比较转录组学的方法，对日本血吸虫各发育阶段及卵壳、体被表达的蛋白进行比较分析、鉴定，获得 3260 个蛋白；最新研究，有学者通过免疫蛋白组学和生物信息学技术，首次发现了30个高免疫反应的表膜蛋白和10个AUC值远远大于0.90的抗原，尤其指出STIP1具有很高的抗原性和免疫原性，这为下一阶段研究抗寄生虫药物和血吸虫病疫苗提供了潜在的目标[51] (2) 多表位、多价疫苗或混合使用不同抗原疫苗，能协同发挥作用，针对不同虫期的抗原杀灭虫体，从而有效提高疫苗的免疫保护效果[52]；(3)新的疫苗递送技术，如新的佐剂、纳米材料、脂质体等，佐剂的使用在疫苗免疫的过程中起到促进和提高免疫保护效果的作用，因此，选择适当的佐剂是有利于疫苗效果的提高；(4)加强对宿主免疫机制的研究。通过研究充分了解宿主感染血吸虫后所引起的免疫反应，将有利于发现更好的抗日本血吸虫病疫苗。