咳喘宁对哮喘大鼠模型中核因子κB和TLR4的影响

引 言
哮喘是一种儿科常见的反复发作的气喘痰鸣的慢性呼吸道疾病，以发作性喉间痰鸣、喘鸣气急伴口唇发绀为表现的疾患，其发病有明显的季节规律，在寒冷的冬季或是气候多变的季节易于诱发[1]。其发病率进年来呈上升的趋势。支气管哮喘是由多种细胞如气道的炎性细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、 elements)参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症导致气道高反应性，通常 自行缓解或经治疗后缓解[2]。近年来，国内外研究发现，全世界支气管哮喘患者约1 亿人，支气管哮喘是儿童时期最常见的呼吸道慢性疾病之一，2000年调查我国0-14岁城市儿童的患病率为0.5%-3.4%[3]。任何年龄层均可诱发哮喘，30%患儿在1岁时有症状，绝大多数的哮喘儿童首次症状在4-5岁前，长期研究指出多半哮喘病患儿在10-20岁时症状消失，但在成人期仍有可能再次被诱发，其中一部分有严重激素依赖并经常住院者约95%转为成人期哮喘，成为严重影响生活质量并危害终生的疾病。
支气管哮喘作为一种免疫调节异常的疾病已经取得了普遍的共识。有关哮喘免疫调节紊乱的机制，其核心是Thl/Th2细胞因子的平衡学说，亦即Thl/Th2细胞所产生的细胞因子有互相制约彼此表型的分化和功能的特性。众多研究表明在哮喘患者中以Th2升高为主，Th1/Th2比例失调是哮喘发病的重要免疫学机制之一，IL-4及IFN-γ已被广泛研究。NF-κB是一种多向性转录调节蛋白，参其中发挥主要作用的是P65一P50异源二聚体。与多种炎症性疾病密切相关，参与调控转录众多的细胞因子与炎症介质的表达，在支气管哮喘的发病机制中，尤其是以慢性炎症作为基础的病理过程中发挥了相当重要的的作用，很多的实验研究表明，哮喘的发病过程中多种炎症细胞内过度编码验证蛋白的基因表达以致大量的细胞、细胞组分等均可分泌大量的细胞因子，他们纵横交错形成网络参与疾病的全过程。NF-κB作为近年来发现的一种重要的有关炎症病理过程中许多炎性介质表达调控的基因转录因子，在疾病的发生、发展的过程中起中枢性调节作用，这也是为什么从NF-κB因子的角度对支气管哮喘的发病机制进行探讨是具有非常重要价值的原因。

目前治疗哮喘的药物首推糖皮质激素和β2受体激动剂，但哮喘仍是发病率、死亡率逐年上升，且严重威胁小儿生命安全，影响小儿生活质量的常见的、严重的疾病。并且反复的使用糖皮质激素和β2受体激动剂亦存在许多限制临床应用的并发症：如糖皮质激素在诱导体内淋巴细胞凋亡的同时能诱导嗜酸性粒细胞的凋亡。其分子机制可能与AP-1与核因子-κB形成，不直接调控基因表达有关。长期应用可以抑制Thl类CK分泌，促进Th2类CK产生，从而导致免疫失衡，不利于疾病的恢复[4]；β2受体激动剂长期使用容易产生β2受体兴奋性下调，效应降低，甚至加重气道炎症和气道高反应性。目前尚无有效的免疫调节剂。
　　中医学在支气管哮喘的治疗上取得了较大的进展，尤其是在病毒诱发的哮喘治疗上有显著疗效，主要反映在分期辨证论治的应用、专方专药的开发、名老中医经验的整理、外治法的深入开展及自制药的研发等等，疗效不断提高，取得了可喜的成绩，显示了中医药的巨大潜力[5]。中药辨证论治新的理论观点百家争鸣，如“发时未必皆实,故不尽攻邪，平时未必皆虚,亦非全持扶正”，“祛风化痰抗哮喘过敏论”等，同时方药层出不穷，内治与外治相结合，形成了多方位、多角度的治疗体系。随着科技的发展中药的剂型不断改进，解决了买药材回家煎药复杂程序，但是目前中药仍存在着不少缺点,如：对生理、病理、药理、医理的描述较模糊，有些未能得到公认，无法用现代医学理论解释，难以令人信服。我院自制的咳喘宁口服液在治疗小儿哮喘的临床疗效显著[6]，以往对于支气管哮喘病因病机及治疗方法的研究于在发作的时候进行症状的控制，在疾病的恢复阶段偏向顾护脾肺后天之本，忽视了对病毒诱发哮喘的防治研究，也没能体现出中医治疗的长处。本实验组通过大量的临床观察和动物实验研究进一步对其发病的机制进行了探讨，认为病原体是小儿哮喘外邪的主要原因，Thl淋巴细胞/Th2淋巴细胞不协调是正气与伏痰之间失调的表现，也是免疫力与Th2类淋巴细胞CK之间失衡的表现，病毒诱发小儿哮喘的原理，祖国医学与现代医学的表达从中西医结合儿科的出发点虽然有很大的区别，但两者关系错综复杂，即：外邪入侵，即为感受病毒，损伤正气，削弱了Thl淋巴细胞对人体的保护支持，引起了潜伏于气道的痰液失宣降，导致Thl淋巴细胞/Th2淋巴细胞平衡被打破，Th2类CK分泌增加，Th1类CK分泌减少，痰气搏结于气道， IgE的水平调高，使嗜酸性粒细胞大量产生并聚集到支气管及肺泡内，炎性浸润，导致气道阻塞，通气功能受损，形成起到高反应性，形成哮喘。在此认识的基础上，本课题组认为“扶正祛邪化痰”这个治疗原则，可调整后天之本，顾护正气，加强清除哮喘激发因素的能力，调整机体免疫状态，使感染病毒性哮喘能减少发病率或减轻哮喘发作的症状，为哮喘的防治开辟一条新的途径。
以往，通过大量的研究，我们曾对其治疗哮喘的机制的现代医学的研究也不少,但欠全面。本论文以此为依据，拟在前期研究基础上，以咳喘宁为被试因素，从动物实验角度来探讨该药对哮喘大鼠NF-κB及TLR4的影响，为咳喘宁口服液的临床应用提供理论支持及实验论证。
（2）咳喘宁治疗哮喘的研究
本院自制药咳喘宁口服液诸药合用，共奏发表清热、化痰平喘、清除哮喘激发因素、降低气道反应性等功效。咳喘宁口服液在临床上主治或佐治小儿哮喘疗效显著。本课题组对于咳喘宁进行了实验及临床研究。
王孟清、朱晔筛选出120例病毒诱发哮喘患儿，治疗组以咳喘宁治疗，对照组以利巴韦林治疗，按随机原则分成2组，各60名患儿。结果显示治疗组总有效率为91.67％，临床控制率为35.00％，均明显优于对照组(分别为76.67％，16.67％)，该观察表明，咳喘宁治疗病毒诱发小儿哮喘具有较好疗效，无论是总有效率还是临床控制率，均明显优于对照组，在改善喷嚏、流涕、咳嗽、咯痰等症状效果更为明显[51]；且性别、疗程与疗效无关，年龄与疗效成正相关，年龄越小，疗效较好[52]。
王孟清、罗银河在此基础上选出120例病毒诱发哮喘患儿，治疗组以咳喘宁治疗，对照组以利巴韦林治疗，按随机原则分成2组，各60名患儿，通过临床研究对哮喘的发病机制进行探讨，表明咳喘宁能显著提高患儿血中IL-12，降低IL-4，其作用明显优于对照组，提示咳喘宁能对病毒诱发哮喘患儿Th亚群产生调节作用，这与哮喘发病机制的经典途径不谋而合[53]，并且提出从干预P13-K、JAKl一STAT6信号转导探讨咳喘宁防治病毒诱发小儿哮喘的新思路[54]，或可通过干预这些信号通路来防治哮喘，并以大鼠为实验模型，对PI3K信号转导进行研究来佐证这一思路[55]。此外，李英进一步证实，哮喘急性发作时，细胞外的增殖分裂信号可能通过STAT6信号转导途径，导致CD4+与CD8+T淋巴细胞的过度增殖分化，咳喘宁通过下调模型大鼠CD4+与CD8+T淋巴细胞内STAT6的表达，纠正哮喘中Th2细胞的过度增殖分化，影响Th2免疫应答优势[56]，从而减少伏痰的产生，达到防治病毒诱发哮喘的目的。
董晓斐以卵蛋白诱发建立哮喘豚鼠模型，并用咳喘宁治疗，采用酶联免疫双抗体夹心（ELISA）法检测各组血中和肺泡灌洗液中sICAM-1 的水平；用改良牛鲍氏记数盘计数血中EOS，采用Wright 染色法显示肺泡灌洗液中EOS；并观察支气管肺组织的病理形态学改变；结果表明咳喘宁能降低肺组织中EOS浸润，从而有可能减少EOS释放的多种炎症介质和毒性蛋白，减低了这些物质对气道上皮产生的直接毒性作用，降低了这些物质诱发的气道变应性炎症的程度，从而降低了气道反应性和平滑肌收缩程度，缓解了支气管痉挛[57]；并且进一步采用酶联免疫双抗体夹心（ELISA）法检测各组血中和肺泡灌洗液中Eotaxin水平，证实咳喘宁可降低哮喘豚鼠血浆及肺泡灌洗液中Eotaxin，从而抑制哮喘发作。Eotaxin的减少是由于咳喘宁抑制了气道上皮和内皮产生的Eotaxin总量，亦或是由于增加了Eotaxin的降解，这亦是对哮喘发病机制的一次探讨[58]。此外；李英通过建立卵白蛋白哮喘大鼠模型并以呼吸道合胞病毒激发哮喘，以咳喘宁口服液治疗后采用免疫组化法和原位杂交法分别检测STAT6蛋白和STAT6 mRNA的表达；结果显示哮喘模型组大鼠肺组织炎症细胞浸润，气道上皮呈嵴状增生或部分脱落，其STAT6蛋白及其mRNA表达较PBS对照组增强，上皮细胞是其主要表达细胞，从而提示哮喘炎症反应时，支气管STAT6过度表达；咳喘宁可下调哮喘大鼠支气管STAT6及其mRNA表达，可能为其防治病毒诱发哮喘的重要机制[59]。
临床上哮喘给药途径较多，雾化吸入疗法能使药物直达气管、支气管树及肺泡的巨大表面而发挥作用，是目前公认的治疗哮喘最佳的给药途径之一，并且雾化吸入给药具有起效迅速、所需剂量小、全身副作用小等优点。我科早期实验表明，五虎汤口服降低小鼠肺组织呼吸道合胞病毒滴度的效果低于雾化吸入，但改善肺部炎症的效果与雾化吸入相等，而剂量仅为雾化的1/10[60]。本实验借鉴前期研究经验采，以咳喘宁为被试因素，从动物实验角度来探讨该药对哮喘大鼠TLR4、核因子-κB的影响，结果表明咳喘宁能有效减少肺泡灌洗中各炎性细胞，控制肺部炎症，再一次证实了咳喘宁治疗哮喘的有效性；TLR4、核因子-κB因子在哮喘大鼠肺组织中高水平表达，咳喘宁治疗后该受体表达水平显著降低，提示哮喘的发生与TLR4、核因子-κB因子高度表达有关，咳喘宁可能通过降低该受体表达水平而控制哮喘，为咳喘宁治疗哮喘提供实验依据，也为临床治疗哮喘提供新的思路，但其具体机制尚不明确，有待进一步深入研究。