香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响及其机制探讨

【摘要】 目的 探讨香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE） 对大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell ，VSMC）迁移的影响，并对其可能机制进行初步探讨。方法 体外培养大鼠VSMC，并分为空白对照组及CSE组，其中CSE组给予5％ CSE处理24小时，应用Transwell方法检测两组VSMC的迁移能力；应用RT-PCR 和 Western blot 方法检测两组骨桥蛋白（osteopontin，OPN ）表达水平。结果 CSE组VSMC迁移能力较对照组明显增强（P ＜ 0.01）；同时CSE组OPNmRNA及蛋白表达均较对照组明显升高（P ＜ 0.01）。结论 CSE能够促进大鼠VSMC的迁移，且其机制可能与上调OPN表达有关。

血管重塑是动脉粥样硬化、高血压等血管相关疾病的共同病理生理过程，而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 向内膜下增殖与迁移是血管重塑的重要病理基础 [1-3]。
吸烟是动脉粥样硬化的重要危险因素之一，参与了血管重塑的发生发展过程，但其机制尚有待研究。骨桥蛋白(osteopontin，OPN ) 是一种分泌型的糖基化磷蛋白，文献报道应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖。本研究拟应用香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）对大鼠 VSMC进行处理，观察其对大鼠 VSMC 迁移的影响，并检测OPN表达水平的变化，从而明确CSE是否通过上调OPN从而促进VSMC的迁移，并进而对CSE参与血管重塑的机制进行初步探讨。

材料与方法
一、材料
1.细胞核试剂 购自美国肯塔基大学烟草健康研究所生产的烟草研究用香烟（3R4F）。大鼠A10主动脉VSMC株购自美国ATCC细胞库。胎牛血清购自杭州四季青公司。RT-PCR逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。OPN兔抗大鼠多克隆抗体、α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz公司。Transwell购自Corning公司。
二、方法
1．细胞培养 VSMC采用DMEM培养基培养（含10﹪的FBS），细胞在5％C02、37℃、饱和湿度条件下培养。每2～3天予以换液一次。待细胞汇合度达到80～90％时，予以传代。
2．细胞分组 培养的VSMC分为2组：1) 空白对照组；2) CSE组 (终浓度为5％的CSE刺激24h)。
3．Transwell 法检测VSMC的迁移能力 应用0.25%的胰酶消化细胞，10%无抗生素DMEM中止消化，离心800rpm，5min，弃上清，无血清无抗生素DMEM 1ml重悬细胞（5×105/ml）。将Transwell下室中加入10% DMEM 600μl，上室置于下室中，取100μl细胞悬液加入上室。37℃、5%CO2饱和湿度培养箱孵育24h后，将上室取出，用沾有PBS的棉签擦掉上室中的细胞，对迁移至滤膜外表面的细胞，用4℃预冷95%酒精固定30min，再用苏木素染色15min，置于1%盐酸酒精分化3s。自来水冲洗15min。将上室的滤膜过夜晾干，用刀片切下，在载玻片上滴加中性树胶半滴，下室面朝上平铺于载玻片上，再滴半滴中性树胶于膜上，盖玻片封片保存。显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的VSMC，每个样本计数5个高倍视野（×200）的穿膜细胞数，取平均值，测定VSMC迁移抑制率。
4．RT-PCR法检测OPNmRNA的表达　反应条件如下 ：94 ℃ 5 min ；93 ℃ 变性30 s，( OPN 54 ℃ ，GAPDH 56℃ )退火30 s，72 ℃ 延伸60s，共 30 个循环，最后72℃延伸10min。扩增结束后取 5μl PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析(120V，45min)，DNAgreen染色，凝胶自动成像分析系统扫描成像，以GAPDH为内参。OPN上游引物5’-GCTGAAGCCTGACCCATCT-3’ ，下游引物5’- TCCCGTTGCTGTCCTGAT-3’； GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。
5．Western blot 检测OPN蛋白表达　加入RIPA裂解液（50mmol/L tris-HCI，PH7.5；1mmol/L PMSF，0.lmmol/L， 50mmol/L NaCI， 1mmol/L EDTA， NaVO4，10mg/ml aprotinin， 10mg/ml LeuPePtin）200μl裂解细胞，将蛋白浓度调至5μg/μl。以每孔50μg 的含量加样，SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 电泳分离。转膜于PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 1 h。加入（1:500稀释的OPN兔抗大鼠多克隆抗体，α–tubulin兔抗大鼠多克隆抗体）4℃孵育过夜。TTBs 洗膜 5 min×3，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TTBS洗膜5min×2，TBs洗膜5min×l，加DAB液显色5-10min。凝胶成像分析系统成像。
三、统计学处理　
所有数据均用 SPSS13.0 软件进行统计学分析，不同组间参数比较用One-way ANOVA 分析，两两比较采用LSD方法，P＜0.05有统计学意义。
结 果
一、CSE对VSMC迁移的影响
与对照组相比，CSE处理组VSMC的迁移能力明显增强（P ＜ 0.01）（见表1）。
二、CSE对VSMC中OPN mRNA表达的影响
RT-PCR检测发现：CSE处理组OPNmRNA的表达较对照组明显升高（P ＜ 0.01）（见图1）。
三、CSE对VSMC中POPN蛋白表达的影响
Western blot结果显示：与对照组比较，CSE组OPN蛋白的表达明显升高（P ＜ 0.01）（见图2）。
讨 论
随着社会经济的发展、人口老龄化和饮食结构的改变，高血压病、动脉粥样硬化、血管支架术后再狭窄等血管相关疾病已经愈来愈严重地威胁着人类的健康。血管相关疾病受多种危险因素的相互影响，其中包括年龄、性别、遗传因素、糖尿病、脂代谢紊乱、吸烟等，其中吸烟被公认为是此类疾病的主要危险因素[4,5]。近年来，吸烟与血管相关疾病的相关性研究已经越来越引起人们的重视，但其相关机制仍未完全明确。
研究发现，血管重塑是血管相关疾病的共同病理生理过程。血管重塑是指血管壁在局部生长因子、血管活性物质及血流动力学等的共同作用下，管壁结构发生改变的主动过程，其主要特征是内皮细胞功能紊乱、VSMC的增殖和迁移以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积。其中，血管中膜平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。
随着对吸烟与血管相关机制研究的深入，人们发现吸烟可促进VSMC增殖，有学者报道其可能与吸烟引起血管活性因子如结缔组织生长因子、内皮素、血管内皮生长因子等的大量释放有关[6,7]，其机制可能与MAPK、PKC等信号传导通路有关[8]。但目前国内外关于吸烟对VSMC迁移影响的相关研究尚少见。
本研究通过应用Transwell方法检测CSE处理过的大鼠A10主动脉VSMC的迁移能力，明确CSE对VSMC迁移的影响。结果显示，与未处理组比较，CSE组VSMC迁移能力明显增强，表明CSE能够显著促进VSMC的迁移，并进而介导血管重塑。在此基础上，我们拟对其机制进行进一步探讨。
根据功能和结构的不同，VSMC分为收缩型和合成型。VSMC由收缩表型向合成表型转化是其增殖、迁移的必要条件。OPN是ECM中一种重要的功能性蛋白，参与骨代谢、肿瘤的生长侵袭、免疫与炎症等多种生命现象，尤其在组织的损伤与修复中受到广泛的关注[35~40]。近年来，多项研究表明，OPN 在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调, 被认为是血管损伤重塑过程中重要的始动因素[41]。大量实验结果表明，OPN是VSMC表型转化的标志基因，合成型VSMC高表达OPN。因此，我们推测CSE极有可能通过上调OPN表达从而促进VSMC的迁移。
为此，本课题组分别应用RT-PCR及Western blot方法检测了CSE处理后的VSMC中OPNmRNA以及蛋白含量的变化，进而对CSE促进VSMC迁移的机制进行初步探讨。结果显示，CSE组OPN mRNA和蛋白水平的表达均较对照组明显增强。该结果表明CSE可通过上调OPN表达从而促进VSMC的迁移。
综上，本研究显示CSE可促进大鼠VSNC迁移，其机制与上调OPN有关。该结果将为进一步阐明吸烟与血管重塑的相关机制提供理论及实验依据。