以酪氨酸酶为基础的时间温度指示系统研究

0前言
在一个食品的整个生命周期中，包括食品后期处理阶段直至被消费者消费在内，现代质量安全控制体系都应通过监测、记录和控制类似于温度这样的关键参数来防止食品被外界物质污染[45]。因此，监测和控制食品在运输和储藏期间的温度条件显得尤为重要[46]。然而目前，我国的食品标签制度是以时间为基础的，也就是我们通常看到的保质期，这种标签制度无法反应食品在实际储存和运输过程中的温度。因此，消费者需要一种有效而直观的方式获得有关食品品质的准确信息[9、47]。时间温度指示器(Time temperature indicator, TTI)，作为一种简单方便、经济有效的装置，在监测、记录和累积指示食品从加工到消费的整个过程中温度历史对食品质量的全部影响有着重要的作用[48、49]。
0.1 TTI定义、分类、原理及缓释材料的应用
0.1.1 TTI定义
时间—温度指示器（TTIs）是一种简易的质量记录装置，可以对产品的整个货架期中的一些关键参数进行操纵、监控和记录，通过时间温度积累效应指示食品的温度变化历程和剩余货架信息[50]。
0.1.2 TTI类型
Schoen 和 Byrne[51]于1972年最早提出指示器可以分为6种类型。而后，Byrne[52]于1976年根据指示器功能和所表达信息的差异，改进了之前的分类方法并提议将指示器划分为3种类型：解冻指示卡；时间温度积分卡和时间-温度积分卡/指示卡。十年后，Singh & Wells[53]又提出了相似的指示器分类方法，该方法也将指示器分为3类，分别为错误指示器；部分经历温度累积器和全部经历温度累积器。国际上现行使用的指示器分类方法为Taoukis等人[54-55]于1991年提出的分类方法。该方法根据指示器的用途进行划分，将指示器分为临界温度指示器(Critical Temperature Indicator, CTI)、临界温度-时间指示器(Critical Temperature/Time Indicators, CTTI)和时间-温度积分指示器(Time-Temperature Indicator, TTI)。
0.1.2.1临界温度指示器(CTI)
有很多产品是温度敏感型的，且当把这些产品暴露于预先设定的温度条件时，就会对产品产生负面影响或导致产品无法使用。这类产品包括食品、药品、血液、疫苗、涂料、乳液和饮料等。因此，将CTI应用于这些产品十分有益。CTI可以准确的显示出产品或环境的温度是否已经下降到低于某一临界值，但并无法显示产品暴露于高于临界温度的时间。CTI的另一个好处是指示器的指示十分迅速并且指示是不可逆的，警告使用者在过去时间中存在的冷冻状态，即使该状态现在已经并不存在。目前有很多CTI利用水的膨胀原理来指示易碎安瓿，还有些用来指示高于临界温度后引起的病菌繁殖和蛋白质变性[56-57]。
0.1.2.2临界温度-时间指示器(CTTI)
CTTI反应的是一种累积效应，它们可以将响应情况转换为产品在某一临界温度下的等价暴露时间。这种类型的指示器可以应用于冷冻食品、药品或摄影胶片，这些产品都可能在储存和销售期间长期暴露于高于临界温度的环境温度下。这种指示器也适用于罐头食品和生物医学材料，这些产品在杀菌消毒的过程中必须在特定的时间段内暴露于临界环境温度之上[58-59]。
0.1.2.3时间-温度积分指示器(TTI)
TTI反应的是一种连续的、累积的时间温度效应，可以在响应过程中表现出易于观察测量的时间温度变化，使TTI可以反映出所指示产品的全部或者一部分温度历史[23]。目前，TTI主要用来反映冷冻冷藏条件下，温度敏感食品的变化过程[60-62]，也可以用来指示产品剩余货架期[1]。基于以上目的，实际生产中对TTI的要求为简单、易于黏附于产品包装上、易于辨识并且与产品的质量变化同步[63]。

0.1.3 TTI工作原理
从TTI出现至今，国际上已经出现了上百个有关TTI的专利。根据工作原理的不同，可以将TTI划分为3类，分别为微生物型、化学型和物理型[64]。它们都是通过时间和温度的综合变化引起的可视化的、不可逆的颜色变化、颜色扩散或者是机械变化进行响应的。目前，国内外科学家所关注的TTI类型主要有：扩散型、聚合物型、酶型、微生物型等[44]。
0.1.3.1 扩散型时间温度指示器
这种类型的指示器工作的基本原理为利用化学混合物(如邻苯二甲酸酷，脂肪酸酷)熔化后的扩散作用，当超过温度设定值时，这些物质则会沿某一确定轨迹（如多孔性灯芯）扩散。人们通过判断这些物质的扩散进度来获知产品的货架期。以扩散原理为基础的指示器一般用作CTTI或CTI，而它们适用的温度和范围则由最初的化学混合物种类及其浓度决定。目前市场已经有两种商业化了的扩散型TTI，分别为美国3M公司的Fresh Check indicator和Monitor Mark indicator[65]。 经过多年的发展，以扩散原理为基础的TTI的形式更加繁多，如专利US5490476 A[66]利用的是磁性分散体组成的细碎的磁性颜料的扩散，而专利US 7430982 B[67]则利用了片层间的扩散原理，将其应用在印刷基材上。
0.1.3.2 聚合物型时间温度指示器
这种类型的指示器是以化学原理为基础的。它们一般利用双取代二乙炔结构的聚合性，通过1,4加成反应，使其形成聚合物[68-69]。反应时间越长，聚合物的颜色越深。这种类型的指示器以固体形态呈现，应用于方便实际应用，不容易受到如运输环境等外界条件的影响[65]。该种类型TTI应用较为普遍的是Lifelines公司生产的Fresh-Check指示器。目前，还有利用价异构反应和氧化还原变色开发的聚合物型TTI[70-71]。但是这种类型的TTI一旦制作完成即自动活化，不易保存[72]。
0.1.3.3. 酶型时间温度指示器
一直以来，这种类型的时间温度指示器就是国内外学者研究的重点，因此该种类型的指示器类型较为丰富。它们主要是通过酶与底物的酶促反应原理引起反应体系的颜色变化，从而实现对产品的指示。目前的酶型TTI主要使用的酶包括脂肪酶[9-11.44.73-74]、α-淀粉酶[2.7.75-76]。利用脂肪酶研制的TTI，其反应主要是利用脂肪酶对底物的水解作用导致整个体系的pH值降低，引起指示剂颜色变化来对产品进行指示。市售典型的VitsabTTI就属于这一类型[77]。利用α-淀粉酶研制的TTI，反应过程利用的是淀粉酶对淀粉的水解作用，通过碘作为指示剂的指示作用来对产品进行指示。该种类型TTI中使用的酶还有β-葡萄糖苷酶[78]、漆酶[79]、脲酶[8.15]、阴离子过氧化物酶[80]等。
0.1.3.4 微生物型时间温度指示器
微生物型TTI也为科学家们广泛研究。与其它类型的TTI相比，该种类型TTI有其自身独有的优势：它们的响应过程与食品的腐败变质过程直接相关[81]。在这些体系中出现的细菌生长与代谢可以被转换为TTI响应情况，从而反应所指示产品由于腐败而引起的质量损失[82]。目前共三种市售微生物型TTI，均由法国Cryolog公司开发。它们的原理利用的都是微生物的生长和代谢活动。Vaikousi、Kerry[46.59.81-82]等人也分别以微生物为研究对象，开发出了不同种类的微生物型TTI。

0.1.4缓释材料聚乙烯醇(PVA)的应用
聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性高分子聚合物，用途广泛且毒性低，美国和日本等国家已经批准将其应用在食品和医药行业。PVA分子链中大量的羟基基团使其表现出良好的成膜性、乳化性以及粘结力。另外，PVA经过改性处理(硬化或化学交联)后，其化学稳定性和机械强度会有显著的提高，并且还会具备一定的生物降解性。PVA价格低廉、易于获得且对生物活性物质并无刺激性，已经在医药、农业、食品等诸多领域有着广泛的应用[84.95]。
目前，PVA在TTI的制备中也有着一定的应用。宁鹏等人[9]研究的一种TTI反应体系中，将PVA加入其中作为乳化剂；而卢立新等人[44]的研究中，PVA则作为凝胶形成物质存在于TTI中。
0.2 TTI的发展历程及技术运用
0.2.1 TTI的发展历程
人们所掌握的最早的用来减缓食品腐败变质的方法，就是将食品进行冷冻。因此，最早设计出的时间温度指示器也是应用于冷冻食品，即将冰块放入每一箱食品中，如冰块融化，则表明食品的储存温度过高。
第一个获得专利的指示器为1933年由Midgley.T开发的一种通过立方体小冰块形状变化来指示食品品质的指示器，若冰块融化则表明人们的操作不当，储存温度过高(Schoen and Byrne,1972)。自此以后，有关时间温度指示器的国际专利越来越多，表0-1列举了TTI国际上的一些重要专利：
表0-1 有关TTI的一些重要专利
Table 0-1 A number of typical patents about TTI

Rmastad和Volz于1950年开发出了最早的酶型指示器。而第一个可以商业化的TTI则由Honeywell公司研制(Renier&Morin,1962)，然而由于该指示器体积大且价格高，因而并没有真正进行应用。1972年，美国陆军Natick实验室开发了一种基于氧化还原理论的TTI(Hu,1972)。该TTI中与时间、温度相关的响应函数为渗透进入薄膜的氧气含量，氧气含量的不同导致反应体系的颜色变化。事实证明，该TTI具有实际应用的可能性。目前仍有许多公司对该种类型的指示器加以研究，其中I-Point、Bio-Medical Science[97-98]和3M公司研制的指示器属于TTI。
出于对价格、适用性及可靠性的考虑，食品厂商不愿意在实际生产中使用TTI。尽管有很多与TTI相关的专利，但是直到20世纪70年代，真正应用于商业化的TTI依然很少。此后，科学家们对于TTI的研究也逐渐递减。目前投入使用的TTI主要有：由3M公司开发的扩散型TTI MonitorMark[99]、由Vitsab公司开发的酶型TTI CheckPoint[100-102]和由Lifelines Technology公司开发的聚合物型TTI FreshCheck[103]。

4.5 小结
本章实验通过查阅文献，并结合实际情况，选取了原料易于控制且附加值高的大菱鲆生鱼片作为研究对象，通过测定大菱鲆从初始至死亡48h内，不同温度(4、12、18℃)下大菱鲆鱼肉中菌落总数、TVBN、pH和失重率变化情况，阐明了大菱鲆生鱼片从0h至48h的质量变化情况。实验结果表明，菌落总数在48h内变化显著，且4℃下储藏48h左右的大菱鲆生鱼片已超出生食标准；而TVBN、pH和失重率在48h内则无明显变化。综合以上实验结果得出，大菱鲆生鱼片在4℃下储藏48h左右已经不宜食用，而TTI的响应时间为50h，两者相近。为从理论上证明该TTI是否可以应用于大菱鲆生鱼片的质量变化指示，对大菱鲆生鱼片的菌落总数进行了动力学分析，得出其48h内变化的活化能为0.009kJ/mol，而本实验中设计的TTI的活化能为0.409kJ/mol，根据Labuza和Kamman1983年的研究，表明了本实验中设计的TTI可以很好地应用于大菱鲆生鱼片的质量变化指示。本章同时设计了一种怀表式TTI结构，该结构可以粘附到生鱼片产品外包装表面，易于激活，保护性良好，结构小巧，且透明材质的设计，方便消费者观察。
5 结论与创新点
5.1 文章结论
本研究利用酪氨酸酶酶促反应原理，以酪氨酸和酪氨酸酶为反应物，探究了其作为TTI使用的可行性，并在此基础上开发出了一种新型固态酶型TTI。通过对固态酶型TTI的响应面分析，优化了TTI的响应时间，对TTI进行了动力学分析并建立了数学模型。探究了将优化后的TTI应用于大菱鲆生鱼片鲜度指示的可行性，并对优化后的TTI装置进行了设计。所得结论如下：
（1）通过对酪氨酸酶液相体系吸光度曲线和褐变趋势的分析，以及单独将酪氨酸固定化于PVA载体上的释放速率单因素试验探究，阐明了开发以酪氨酸酶酶促反应为基础的新型固态TTI的可行性。而固定化有酪氨酸的单因素实验结果则表明，酪氨酸在固定化后可以从PVA薄膜中缓释出来与酪氨酸酶进行反应，且在PVA浓度为15%，Tyr含量为18mg(/30.0mL双蒸水)，采用冻融方法成膜后，整个反应体系酪氨酸的释放速率最低，体系达到指示终点的时间约为18h。
（2）将酪氨酸和酪氨酸酶分别固定化于PVA缓释薄膜，开发出了一种新型的以酪氨酸酶酶促褐变原理为基础的固态酶型时间温度指示器。该指示器可通过颜色变化和扩散圈来指示TTI的响应时间。通过单因素实验，确定了各因素的取值范围，成功的建立了以TTI响应时间为响应值，以酪氨酸含量、酪氨酸酶含量以及PVA浓度为自变量的数学模型。根据模型预测，确定了TTI达到最长时间时各因素的取值：酪氨酸30.08mg，酪氨酸酶0.30mL，PVA15.18%，此时TTI的最长响应时间可以达到50.4763h。
（3）选取响应面实验中TTI响应时间最长组配方，制备TTI并对其进行动力学分析。结果表明该TTI的反应活化能Ea=0.409 kJ/mol，指前因子A=2.91。采用SAS软件对TTI进行数学模型的分析，结果表明，时间t、温度T和响应值F(X)之间满足一个二元二次函数关系式F(X)=-0.00586T2-0.24002T+0.00902T×t-0.02060t-1.73930，该式中R2=0.9661，说明模型拟合度良好，可以用该模型来预测不同时间温度条件下，TTI体系颜色响应值的变化。
（4）通过查阅文献，并结合实际情况，选取了原料易于控制且附加值高的大菱鲆生鱼片作为研究对象，通过测定大菱鲆从初始至死亡48h内，不同温度(4、12、18℃)下大菱鲆鱼肉中菌落总数、TVBN、pH和失重率变化情况，阐明了大菱鲆生鱼片从0h至48h的质量变化情况。实验结果表明，大菱鲆生鱼片菌落总数在48h内变化显著，且4℃下储藏48h左右的大菱鲆生鱼片已超出生食标准；而TVBN、pH和失重率在48h内则无明显变化。综合以上实验结果得出，大菱鲆生鱼片在4℃下储藏48h左右已经不宜食用，而TTI的响应时间为50h，两者相近。而对大菱鲆生鱼片鲜度变化的动力学分析表明其鲜度变化的活化能为0.009kJ/mol，与TTI的活化能0.409kJ/mol相差很小，这表明本实验中设计的TTI可以很好地应用于大菱鲆生鱼片的质量变化指示。实验中同时设计了一种怀表式TTI结构，该结构可以粘附到生鱼片产品外包装表面，易于激活，保护性良好，结构小巧，且透明材质的设计，方便消费者观察。
研究表明开发出的新型固态酶型TTI反应体系简单，颜色变化明显，可以用于判断极易腐败低温流通食品（如大菱鲆生鱼片）的新鲜程度，对于消费者更准确地判定此类食品的新鲜度有着积极的意义。

5.2 文章创新点
采用酪氨酸酶酶促反应原理，开发了一种固态酶型TTI。利用该TTI响应时间较短的特点，将其应用于大菱鲆生鱼片的鲜度指示，并对该TTI装置进行了设计。