二苯乙烯苷对小鼠肝脏P450酶蛋白表达的影响

目的 本实验通过检测二苯乙烯苷对小鼠肝脏P450酶蛋白表达的影响，从而为临床合理用药提供基础药理学依据。 方法 昆明种雄性小鼠随机分为空白组、二苯乙烯苷低剂量组和高剂量组，灌胃3、5、7 d后，麻醉处死小鼠并取其肝脏，通过蛋白免疫印记试验（western blot）检测小鼠肝脏组织CYP相关蛋白的表达。 结果 (1) 二苯乙烯苷低剂量和高剂量作用3d后均能显著增加CYP3A4蛋白表达，而5d和7d则抑制其表达；(2) 二苯乙烯苷高剂量作用3、5、7d后抑制CYP2E1蛋白表达；(3) 二苯乙烯苷高剂量作用3、5、7d后能够抑制CYP1A2蛋白表达；而低剂量作用7d后抑制CYP1A2 蛋白表达。 结论 二苯乙烯苷对CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4有显著影响，对临床联合用药、减少药物毒副作用、增强药效具有重要的参考价值。
关键词：二苯乙烯苷 小鼠肝脏P450酶蛋白 蛋白质免疫印迹
Impact of Tetrahydroxystilbene Glucoside on Cytochrome P450 Protein Expression in Mouse Liver
Object:To detect the effects of tetrahydroxystilbene glucoside (TSG) on cytochrome P450 (CYP) in mouse livers and provide the basis for pharmacological evidence for clinical rational drug use. Method：Male Kunming mice were randomly divided into the control group (treated with the same dose of Saline solution ) ,the low dose group and high dose group of TSG . Gavaged for 3, 5, 7 days after anesthesiae respectively, the mice were killed to take their livers and detect the expression of CYP protein in mouse liver by Western blotting test . Results ：(1) After 3 days’ treatment ,the low dose and high dose significantly increased the expression of CYP3A4, but inhibited the expression after 5 and 7 days. (2) The high inhibited the expression of CYP2E1 protein 3, 5, 7days after intragastrical administration. (3)The high dose inhibited the expression of CYP1A2 protein 3, 5, 7days after treatment ,while low dose inhibited the expression of CYP1A2 protein 7 days after treatment. Conclusions Tetrahydroxystilbene glucoside has significant effects on CYP1A2, CYP2E1 and CYP3A4 protein expression in mouse liver. It is important reference value of clinical combination therapy, which can reduce drug side effects and enhance efficacy .
Key words： tetrahydroxystilbene glucoside The enzyme protein P450 in mouse liver Western blotting
　　药物在体内的转化主要是在肝脏内进行，由药物代谢酶代谢转化[1]，细胞色素450 酶系(简称CYP 450S)是肝细胞药物代谢的主要酶系，大量研究证明了CYP表达活性易受到抑制，从而导致底物药物的代谢变慢，体内药物浓度增加，毒副反应的发生。因此，在药物的研发阶段有必要考察药物对肝药酶的诱导或抑制作用，以确保用药安全。该酶存在许多同工酶[2]， CYP与药物代谢有密切关系的酶主要为CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4，约占肝脏代谢酶的12%、6%和29%[3] 。 研究表明，某些中药可通过诱导或抑制肝药酶而对其他药物产生增加毒性或减弱药效等不良作用，尤其在几种药物共同使用时更应加以注意。研究中药对CYP的影响有助于全面揭示中药在联合用药时发挥药效或导致毒副作用的规律，预测临床联合用药所致的药物间相互作用、防止配伍用药后的不良反应。本实验室前期研究发现一些中药能够影响CYP的活性[4，5], 因此，研究药物对CYP的影响，对于掌握其他药物在体内的代谢转化程度，及选择其用量的上有十分重要的参考意义。何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)，为蓼科草本植物[6,7]，长期的研究表明何首乌具有延缓大脑衰老、增强人体免疫力,以及改善脂肪代谢和降低胆固醇等作用[8]。近期以来的研究已经发现何首乌中的许多种成分各具药效，其中二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside, TSG）是何首乌的主要药效成分之一。研究发现，TSG具有抗衰老、增强免疫、调节血脂、抗氧化、提高学习记忆力、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤及保肝等作用[9-11]。鉴于TSG拥有如此广泛的药理作用，与其他药物联合应用的可能性也比较大，但与此相关的研究尚未见报导。本研究拟采用Western blot法探讨TSG对小鼠肝脏P450酶蛋白表达的影响，以期为临床联合用药提供依据。
2 方法和步骤
2.1 实验分组和给药方式 昆明种雄性小鼠45只，随机分为3组，每组15只：①空白组，②TSG低剂量组（10 mg/kg），③TSG高剂量组（40 mg/kg）；TSG组每天灌胃给予TSG溶液，空白组灌胃给予药物等体积的生理盐水。
2.2 取材 药物灌胃3、5、7 d后分别用7% 水合氯醛麻醉小鼠，固定，剪开腹腔取肝脏。
2.3 组织中总蛋白的提取 取少量肝脏组织块剪切成细小的碎片。在适量的裂解液中加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。按照每20毫克组织加入150—250微升裂解液的比列加入裂解液（如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液）。将组织进行匀浆，直至充分裂解。裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃于12000rpm离心20min,再取上清（即蛋白）分装于离心管中并置于—80℃保存。
2.4 BCA法测定蛋白浓度 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mgBSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，配好后即可使用，也可以—20℃长期保存。取20μL 25mg/ml蛋白标准，加入980μL稀释液（PBS）配制成0.5mg/ml的蛋白标准。根据样品数量配BCA ， A试剂：B试剂=50:1，充分混匀。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加至96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液（PBS）补足20μL。各孔加入200μLBCA工作液，37℃电恒温热鼓风干燥器中放置20—30min，用酶标仪测定570nm处的吸光度值。以蛋白含量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。（7） 样品测定：将待测蛋白样品1μL用49μL的PBS稀释，取20μl 样品，加入200μl BCA 工作液，混匀后37℃放置30 分钟，测定样品吸收值。（8）根据测得的吸收值，在标准曲线上计算得样品的蛋白浓度。（9）计算实际蛋白浓度：以计算所得的蛋白含量，再乘以稀释倍数50即可得到待测样品的实际浓度。
2.5 Western blot法测定蛋白 （1）蛋白量一般在80μg-100μg，本次蛋白用量以100μg为准。用蛋白量100μg除以实际浓度就能得到蛋白体积即样品体积，样品加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×），样品体积和上样缓冲液的体积比例为4:1，蛋白上样体积一般最好在10μL，若没有达到，用PBS稀释数倍，再用稀释后的体积与上样缓冲液配比。用多功能梯度PCR仪高温变性5min。（2）制备凝胶：安装玻璃板，板条，并将玻璃板固定在制胶槽上，按照表1将所需溶液体积依次加入烧杯中配制分离胶溶液，加完TEMED后立即摇匀用移液枪进行灌胶。（3）灌胶速度要快，将分离胶溶液小心地灌至两块玻璃板中间的间隙内，但需要注意的是，要给积层胶留出足够空间，待胶面升至绿带下沿即可。在分离胶的溶液面上立即加入饱和正丁醇进行封闭，以防止空气中的氧对凝胶聚合产生抑制作用，加正丁醇封闭应迅速而温和。将凝胶垂直放置于室温下进行凝固。（4）当水和凝胶之间出现一条折射线时（大约30min），说明分离胶成凝胶态，倒掉胶上层正丁醇，再用滤纸吸净残留的液体。（5）将积层胶溶液按表2 给出的数值并按顺序依次加入烧杯中摇匀，再用移液枪将其灌至到聚合好的分离胶上，将剩余空间灌满后立即在其中插入梳子。插梳子时要使梳子保持水平，注意不要混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下过夜。（6）待积层胶聚合完成后，两手分别拿住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，防止凝胶扭曲。（7）用水冲一下积层胶，将玻璃胶板放入电泳槽中，小玻璃面向内，大玻璃面向外，并安装好电源。把5×电泳缓冲液用双蒸水稀释成1×缓冲液后加入电泳槽中，一般将回收的电泳液加入电泳槽下半部分，上半部分用新鲜电泳缓冲液。在第一个加样槽中用小枪贴壁加入P0068彩色预染蛋白质分子量标准2.5μL，其余各孔按照预定的顺序依次加入空白组、低剂量组和高剂量组。（8）将电泳装置开关打开，当染料在积层胶是电压为60V，待染料前沿进去分离胶时将电压提高到100V，直至溴酚蓝染料到达分离胶带底部，关闭电源。剪PVDF膜（长8cm,宽1cm），用甲醇泡20min。
（9）电泳结束后，将玻璃片去下，大朝上，小朝下，进行切胶。用滤纸画好横线，铺在玻板下面切胶，将剪下的胶铺在滤纸上，盖上事先用甲醇侵泡的PVDF膜，用玻璃棒撵去其中的气泡，再盖滤纸（制备“三明治”），插上电源恒流220mA,时间为分子量的2倍，电转时会产生热，需要在周围放置冰块降温。电转完毕后，可用立春红染色观察蛋白，也可以不用。（10）洗膜：将膜取出放入平皿中，贴胶面为正面，使正面朝上，剪右下角标记，放置在恒温摇床上用TBST洗膜10min，倒弃液体，再重复两次，共洗涤三次。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭90min,再取出用TBST洗3次，每次10min。（11）将一抗按照1:1000用一抗稀释液稀释，取出膜放入配制好的一抗溶液中，膜正面朝上，4℃孵育过夜。
（12）膜取出后用TBST液洗膜3次，每次10min。加二抗（按1:1000用TBST稀释）10ml后封闭90min。再用TBST洗膜10min,重复二次。（13）曝光（暗处操作）：用滤纸适当吸干膜上溶液，放入盒盖上，等体积混合适量BeyoECL PlusA液和B液，将混合的显影剂均匀涂抹于膜上，置于Chemi Dos Xps电泳凝胶成像系统中开始曝光。β-actin作为内参对照,进行细胞间蛋白表达的比较，用凝胶分析软件Quantity One 进行分析。
2.6 数据统计与分析 各组数据以均数（）±标准误（SEM）表示，采用SPSS16.0 统计软件中单因素方差分析进行数据统计，以 P<0.05 认为有统计学差异。3 结果 3.1 TSG对小鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4蛋白表达的影响　　Western Blot 分析结果显示, 与对照组比较,3d的CYP3A4蛋白表达明显增加，而5d和7d的CYP3A4蛋白表达受到抑制；3d、5d和7d的CYP1A2和CYP2E1蛋白表达被抑制，3.2 不同剂量TSG对小鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4蛋白表达的影响 如图2所示，TSG低剂量和高剂量作用3d后均显著增加CYP3A4蛋白表达，5d和7d则抑制其表达；TSG高剂量作用3、5、7d后抑制CYP2E1蛋白表达；TSG高剂量作用3、5、7d后能够抑制CYP1A2蛋白表达，而TSG低剂量作用7d后抑制CYP1A2 蛋白表达。4.讨论 　　细胞色素P450酶系是一组血红蛋白偶联单加氧酶，存在于肝脏及其他肝脏外组织的内质网中，需要分子氧和辅酶NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯的还原态）的共同参与，主要参与药物转化中的氧化反应（包括脱氢和氧化反应）。CYP450通过“活化”分子氧，使其中一个氧原子和有机物分子相结合，与此同时将另一个氧原子还原为水，从而在有机药物分子中引入氧。CYP450催化的反应类型主要有多核芳烃、烯烃及卤代苯的环氧化反应；芳香化合物和烷烃的氧化反应；叔胺及醚的脱烷基化反应。肝脏微粒体中有多种亚型的CYP450，但真正参与药物代谢的CYP450却不多，尤其是体内有很多药物由同一个酶代谢氧化。若两个药物同时使用，且同时由一个酶代谢时，则其中一个药物会降低CYP450对另一个药物的代谢，使另一个药物代谢减少，体内浓度增加，可能会导致其药效增强和毒性增加。大量的研究表明，影响药物相互作用从而导致不良反应的发生最重要的酶为 CYP3A4，它是CYP3A亚家族中最为主要的组成形式之一，也是CYP450最重要的成员，其参与代谢150多种38个类别药物的氧化代谢，约占全部药物总量的50%[12]。CYP2E1是CYP2E亚家族中仅有的成员，也是许多药物及低分子有机化合物在体内的重要代谢酶[13]。机体对环境中致癌物或毒物的敏感程度可能受CYP2E1的影响。CYP1A2是一种由多环芳香烃诱导产生的CYP亚型，它能影响前毒物和前致癌物的激活及药物代谢过程。一般说来，酶活性的水平是相对应的，肝脏内CYP1A2的合成减少可能是受炎症和肝硬化的影响，积极开发对CYP1A2有影响的药物将有利于癌症等疾病的治疗。通过本实验研究发现，TSG能够对CYP1A2和CYP2E1蛋白表达产生抑制作用。近年来研究结果揭示，化合物对CYP1A2的抑制作用主要与分子的芳香性和形状、以及跟氢键结合能力有关，芳香性越高、分子形状越小、与氢键的结合能力越强，化合物就越有可能成为CYP1A2的抑制剂[14]；而CYP2E1表达水平受到多种因素的控制，其中包括病理生理状态和内源性物质[15]。本实验结果表明TSG在与通过CYP1A2和CYP2E1代谢的药物联用时，可能会减慢其他药物的代谢，导致其他药物在体内浓度增加。应适时调整联合用药的给药剂量，从而避免药物因相互作用引起不良反应，从而影响药物的疗效和安全性。除此之外，本研究发现TSG对CYP3A4蛋白表达表现出先诱导，后抑制反应。CYP3A4在体内增加的机制主要有以下两点，其一是酶蛋白稳定性或抗降解能力增强，其二是因为CYP3A4基因转录水平增加；非竞争性、竞争性及不可逆性抑制是CYP3A4抑制的主要机制。最近相关的研究发现，CYP3A4的表达增加与脂质过氧化损伤程度密切相关，通过造成体内氧化-抗氧化水平失平衡，进而导致肝内氧化应激反应，产生大量活性氧自由基和脂质过氧化物，从而引起肝脏炎症反应[16, 17]。综上所述，本实验发现TSG对CYP1A2、CYP2E1蛋白表达具有抑制作用，对CYP3A4 蛋白表达先诱导，后抑制。因此，本研究初步评价了TSG对小鼠CYP亚家族蛋白表达的影响，为其在临床应用中产生相互作用的可能性提供了依据，但有关TSG对CYP酶活性及具体机制的影响还有待进一步的研究。5 结论 二苯乙烯苷对CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4有显著影响，对临床联合用药、减少药物毒副作用、增强药效具有重要的参考价值。