生物转化法制备9αOHAD

1.1 甾体化合物的概述
　　　甾体化合物（steroids）又称类固醇化合物，是环戊烷多氢菲类化合物的总称[2]。其普遍存在于动物、植物组织和微生物细胞中。甾体化合物一般都含有一个由四个环A、B、C和D稠合组成的基本骨架，A、B、C环为六元环，D环为五元环，这个骨架就是甾族化合物的母核，即环戊烷多氢菲。将17个碳原子按特定顺序编号。通常A/B环稠合处和C/D环稠合处各有一个角甲基，在D环17位有侧链[3]。第3、11、17位可能有酮基（-C=O）或羟基（-OH），A环或B环存在部分双键，大多数甾体化合物由于甾体母核上取代基、双键位置和立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。[4,5]其结构通式为：

图1-1 甾体化合物的结构通式
Fig 1-1 The basic structure of steroids
　　　随着甾体类药物在医药领域需求量的不断增大，其制备技术也得到了越来越广泛和深入的研究。甾体类药物大多为在医药上占有重要地位的激素类药物，如氢化可的松（又名皮质醇，Hydroeortisone），皮质酮 （Corticosterone），睾酮（Testosterone）、雄酮（Androsterone）、雌二酮（oestradiol）和孕酮（progesterone）等，对机体起着非常重要的调节作用，如肾上腺皮质激素能缓解或治疗胶原性疾病、过敏性休克等危险或难治的疾病，以及治疗阿狄森氏病等内分泌疾病。各种性激素药是治疗雄性器官衰退和妇科疾病的主要药物，是治疗前列腺癌、乳腺癌的辅助治疗药物，同样也是近年来市场需求旺盛的口服避孕药的主要成分。因此，甾体类药物在临床医学上占有重要地位。其大致分类如下：
（一）类皮质激素（Corticoid），如：氢化可的松、可的松、地塞米松、强的松、泼尼松、氟轻松等。按其生理功能又可分为两类：（l）盐皮质激素（Mineralocorticoids），主要作用于水盐代谢，对维持机体的体液容量和电解质平衡起着重要的作用；（2）糖皮质激素（Glueocorticoid），对糖、脂肪和蛋白质三大类物质代谢都具有重要的调节作用，并且能提高机体对不良刺激的抵抗力。
（二）性激素，主要包括雄性激素和雌性激素两类，主要是由睾丸和卵巢分泌的物质，临床上经常用于治疗妇科疾病、消耗疾病、贫血等，对生育功能及第二性征的改变都有决定性的作用。
（三）蛋白同化激素（Androgenic-naboliec steroids），是从睾酮衍生物中分离出来的药物，主要有7α-甲基去氢睾丸素、苯丙酸诺龙等。其性激素的作用已经大为减弱，而蛋白的同化作用仍然保留或增强，因此使用安全。主要生理功能是促进蛋白质合成、抑制蛋白质异化，促进骨组织的生长和钙化，刺激骨髓造血的功能，增加红血球量，促进组织新生以及肉芽的形成，降低胆固醇等。
　　　另外，甾体类药物还被开发为抗细菌药、麻醉药、抗心率失常药、抗凝血剂、抗胆碱酯酶药、抗真菌药、抗肿瘤药、胆汁分泌剂、抗原生动物药、诊断剂、神经调节阻断剂、止血剂、钙调节剂、胆石分散剂、脂调节剂、神经病治疗药、安定药、泻药等。因为甾体类药物不可取代的功能及其治疗适应症的不断增大，越来越引起人们的重视和开发。[6]
1.2微生物转化法制备甾体化合物
　　　甾体化合物广泛存在于动、植物组织和微生物中，但是从自然界获取的天然甾体化合物，活性较低，必须对其进行结构上的改造，克服其毒副作用，增强其治疗活性。早期的甾体药物生产主要集中在化学合成方面，但是单一地应用化学方法时，往往合成步骤繁多，且得率低，价格昂贵。1946年， Merck公司的sarett等科学家曾经尝试这项艰难的工作[7]，他们一共用了1270磅脱氧胆酸作为原料，经历了两年的时间，通过三十余步的化学反应，但最终仅合成了938mg醋酸可的松，经济效益几乎为零。微生物转化是由微生物生长代谢的一种或几种酶作为生物催化剂而进行的一种或几种化学反应。微生物转化应用于生产后，甾体药物的生产主要采用化学法和微生物转化法相结合的方法。而微生物转化在整个生产工艺过程中占有及其重要的地位。
1.2.1 微生物转化法制备甾体化合物的优点
　　　与传统的化学合成方法相比，微生物转化方法具有以下优点：[8,9]
减少了合成步骤，缩短了生产周期。比如，用化学合成方法需30多步反应而将孕酮合成可的松，而微生物转化法只需要3步就可以完成。
反应条件温和，避免使用一些强酸、强碱和有毒原料，公害少，设备简单，生产安全。
反应具有区域选择性和立体选择性。比如，羟化反应可以专一地在9、11位等羟化，选择合适的微生物也可以实现α或β位的转化。
提高收率，减少副反应。
比较复杂和难以进行的有机化学反应，采用微生物转化法可以迅速地、专一的完成。
1.2.2微生物转化法制备甾体化合物的工艺过程
　　　甾体化合物微生物转化的过程可以用以下方式表示：

甾体化合物的微生物转化一般分为两个阶段，第一个阶段是：菌体的培养，为了提高转化率一般都要将菌体培养到一定的浓度，菌体、酶活等都处于较好的阶段时将其转入第二阶段。第二个阶段是：底物的加入，因为一般底物在水中的溶解度较低，导致底物与菌体接触不好，影响转化率和发酵周期，所以要采取相应的措施，增加底物的溶解性，进而提高转化率。这也是微生物甾体转化工业中的最主要的问题之一。[10-12]
1.2.3微生物转化甾体化合物的反应类型
　　微生物对甾体每一个位置（包括甾体母核和侧链）上的基团或原子都有可能进行微生物转化，因此微生物转化的反应类型是多种多样的。[13]主要反应类型有：氧化、羟化、脱氢、芳构化、环氧化、酮基还原成羟基、双键的氢化等。其中9α羟基化反应是在甾体化合物微生物转化反应中的重要反应类型。
1.3 甾体的C9α-羟基化反应
　　甾体的羟基化作用在微生物转化中是广泛存在的，在甾体中间体的代谢中起着重要作用，可以使甾体母环相关位置发生置换并消除母环相关位置的空间位阻效应使其可以发生其它反应。[14-16]C9α-羟基化是重要的甾体转化反应之一，对于甾体化合物的合成和结构的改造具有重要意义。C9α-羟基化是甾体药物合成过程中的一个关键步骤，它不仅与甾体的选择性降解有密切的关系，还为甾体药物合成提供了关键中间体。由于9α-OH的存在，大大地提高了反应活性，且更易于合成其他糖皮质激素类药物。
1.3.1 微生物转化植物甾醇制备9α-OH-AD的反应原理
　　　植物甾醇，是从玉米、大豆中经过物理提纯而得，具有营养价值高、生理活性强等特点。其具有甾体激素所需的具有甾体激素所需的环戊烷多氢菲母核部分，而且都具有A/B, C /D角甲基，其4个环结构合乎激素立体化学排布的要求，易于转变为甾体激素所需的Δ4-3-酮的结构。[17]
　　　甾醇的发酵降解断侧链, 产生C-17酮甾体（AD（ D ），9α-OH-AD）是一个复杂的微生物多酶体系分解代谢过程。[18]微生物先将植物甾醇氧化成甾酮，再将C链末端氧化成羧酸通过β氧化去掉侧链形成AD。微生物物发酵降解植物甾醇的侧链，在酶抑制剂的存在下对甾体的侧链进行选择性降解，防止甾体母核的破裂。
　　　3-甾酮-9α-羟基化酶（KSH）是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在。KSH负责在甾体的多元环的第9位上引入一个羟基（9α-OH）。科学家们通过同位素示踪法证明了，转化到甾体上的羟基是直接取代原来碳骨架上的氢的位置，并且在取代过程中并没有发生立体构象的改变。经过18O2，D2O和H2O18分别实验发现，羟基化反应的氧不是来自自来水中的氢氧根而是来自空气中的氧，这也解释了为什么制备9α-OH-AD的时候需要的转速较高。[19]微生物转化制备9α-OH-AD的过程如图1-2所示。

图1-2微生物转化法制备9α-OH-AD
Fig.1-2 Microbial transformation of 9α-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione
1.3.2 微生物转化植物甾醇制备9α-OH-AD难题的解决方法
　　　近年来，虽然在微生物转化方法制备甾体类药物方面已经取得了显著的成果，但是仍然迫切需要一种快速、高效的微生物转化方法来制备有价值的甾体化合物。[20]在微生物转化方法中，除了底物在水中的溶解度低外还存在其他的一些问题，其中最主要的就是底物的溶解度过低，1-100μM。[21]由于过低的溶解度直接影响底物与生物酶的接触，直接影响转化率和发酵周期。表1-1中列举了一些提高微生物转化甾体化合转化率的方法。
　　表1-1提高转化率的方法
　　Tab.1-1 Methods to improve the conversion rate
　方法名称 　方法明细
　底物微粉 　将底物进行粉碎，制成及其微小的颗粒，超声波与分散剂相结合的方式
　双水相系统 　用正己烷、丁醇等有机溶剂将底物进行溶解，增加底物的溶解性
　使用能与水混
　溶的有机溶剂
　 　使用能与水混溶的有机溶剂能有效地克服了底物与菌体接触不好的问题
　
基于非离子表面活性剂的浊点系统 此方法是一种全新的两相系统，应用于全细胞转化的过程中，降低了底物与产物的抑制作用，也阻止了产物的降解。
基于液态聚合物的系统 使用硅油、聚丙二醇、聚甲基硅氧烷等液态聚合物来溶解底物，有效积累甾体化合物
　环糊精 　环糊精的使用不仅提高了底物的溶解度，并且提升了细胞膜的通透性
提高细胞膜的通透性 　甘氨酸、卵磷脂、抗生素、D/L-正亮氨酸等均可提高细胞膜的通透性
设计合理的发酵培养基及培养条件 　培养基的营养成分搭配合理、温度、pH值等条件均影响转化率
　固定化细胞 常用海藻酸盐凝胶等，有利于生物催化剂和产物的分离以及细胞的重复利用，采用疏水性介质提高底物及产物的分散和传质
1.4甾体类药物的国内外研究动态
　　　甾体类药物是临床需要的重要药物，有着稳定的市场。美国、日本、欧洲和我国是世界甾体激素类药物的主要产国。但是我国的低档产品产量高，而高档产品产量太低的结构缺陷，导致我国缺乏国际竞争力。国际市场一方面吸收我国的低档产品，另一反面倾销高档产品到我国，大量的皂素资源被消耗，我国甾体药物生产想挽回劣势，势必应及早开发价廉易得的新型甾体资源。[22]
　　　国外甾体激素类药物制造业，特别是性激素避孕药的生产过程，由于可通过植物甾醇发酵降解，产物AD（D）作为半合成中间体，故该类甾体激素药物的生产工艺已经发生了很大的改进，使传统的由薯蓣皂素制造性激素避孕药物工艺已经被工业化规模生产的AD（D）的流程所取代。早在1979年美国普强制药公司报道利用偶发分枝杆菌突变株发酵谷甾醇断侧链，有效积累有用中间体9α-OH-AD，以此中间体经7步化学合成，制得乙酸氢化可的松，总收率达36.7% [ 23]。
1.5 本论文的研究意义
　　　如今，甾体类药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物[24]。医药界的需求量日益上涨，找到一种高效、低耗、绿色的方法来制备甾体化合物已经迫在眉睫。
　　　20世纪30年代中期，日本人藤井胜也、家本赳夫等从山蓖鲜中分离出了薯蓣皂素，为生产甾体类药物奠定了基础。薯蓣皂素作为合成甾体药物的良好原料，在相当长的一段时期内，占据着主导地位，当前世界各国用来制取甾体药物的天然资源仍大多数是薯蓣皂素（约占70%），我国基本上全部以薯蓣皂素为原料。[25-28]由于自然资源的逐渐匮乏，化学合成工艺路线繁长、“三废”污染严重，上世纪60年代人们开始采用微生物转化广泛存在于动、植物体内的甾醇。[29]
　　　由于甾体药工业对薯蓣皂素的需求日增，而薯蓣资源日渐枯竭，迫使公司努力开拓新资源。植物甾醇作为甾体化合物制备的一种新原料，对其进行开发利用，无疑有效改变了我国甾体激素药物半合成原料薯蓣皂素的短缺局面，实现了甾体激素药物半合成原料多元化，科学合理利用我国甾体植物资源具有重要的意义。[30, 31]
　　基于以上原因，本论文研究了以植物甾醇作为转化底物，通过菌种的诱变筛选出活性和转化率均较高的菌株，并且优化了发酵培养成分及发酵转化的条件，克服了实验中的种种障碍，大大提升了转化率。获得了一种简单、高效、环保的方法成功地将植物甾醇转化成了9α-OH-AD。为以后应用微生物转化法制备9α-OH-AD的工业化发展奠定了坚实的基础。