长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞影响及其氧化损伤机制研究

摘要
目的:
分析长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞的影响,为筛选低浓度砷暴露的早期损伤指标提供依据;
检测长期低浓度砷暴露对人群DNA氧化损伤的影响;
探讨饮水型砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害的关联性,为砷的毒作用机制研究提供一定的依据。
方法:
   选择相邻经济发展均衡的山西大同地砷病区 ( 水砷含量为14.41~90.34 μg/L ) 和非地砷病区(水砷含量为0~0.87 μg/L)2个自然村,饮水年限20年以上本地居民,无传染性、遗传性等疾病,无放射线和理化致病因素接触史156人为调查对象。用全自动血细胞分析仪分析测定人群血细胞参数的变化。原子荧光光谱法测定研究对象体内尿砷水平,ELISA试剂盒测定其血清8-OHdG的含量。由两名经过培训的皮肤科医生确定研究对象皮肤损害的程度。按照皮肤损害程度的不同分为无皮肤损害组(即正常组)、轻度皮肤损害组、中度皮肤损害组和重度皮肤损害组。
结果:
长期低浓度砷暴露对人群外周血血细胞参数的影响
1.1 白细胞各项指标:与对照组比较,砷暴露组WBC、GRA、GRA%、LYM和LYM%均增加,其中LYM和LYM%的增加有统计学意义(P均<0.05);1.2 红细胞各项指标:与对照组相比,砷暴露组RBC、HGB、MCH、MCHC和RDW升高, MCV下降,差异均有统计学意义(P均<0.05);1.3 血小板各项指标:与对照组相比,砷暴露组PLT、MPV和PCT下降,PDW升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。长期低浓度砷暴露对人群DNA氧化损伤的影响2.1 与对照组相比,砷暴露组的水砷、尿砷和血清8-OHdG含量均增加,且差异均有统计学意义(P <0.05);2.2 多元线性回归分析显示,血清8-OHdG的含量与水砷、年龄和尿砷呈正相关;2.3 免疫荧光检测显示,砷暴露组人群白细胞中的8-OHdG和8-NitroG含量均增加,且8-OHdG和8-NitroG的表达基本一致。3. 长期低浓度砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害的关联性3.1 不同皮损组的尿砷和血清8-OHdG分布差异均有统计学意义(P <0.05);与正常组相比,轻度、中度和重度皮损组血清8-OHdG含量均增加(P<0.05);与轻度和中度皮损组相比,重度皮损组的尿砷浓度和血清8-OHdG含量均升高(P<0.05);3.2 Logistic回归分析显示,年龄和8-OHdG是砷暴露人群皮肤损害的主要危险因素 ( OR=9.874, P<0.05; OR=6.084, P<0.05 )。结论: 1. 长期低浓度砷暴露能引起人群外周血血细胞参数的改变。白细胞和红细胞增加,血红蛋白浓度升高,血小板数目明显减少;血小板和红细胞体积异质性增加。2. 砷暴露可加剧人群DNA的氧化损伤;3. 长期低浓度砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害之间存在一定的关联性。   关键词:低浓度砷暴露;流行病学;外周血血细胞;DNA氧化损伤;皮肤损害;8-OHdG研究背景   砷是地壳的组成成分之一,多以化合物的形式存在。常通过天然含砷岩层自然风化溶解和人类活动(金属矿物的开采冶炼、高砷煤燃烧、砷化合物用于玻璃、颜料、农药、药物、纸张、木材、制革、纺织、化肥生产/制造等)污染环境。尤其是近年来大量开发利用地下水源,地域性水体砷含量过高引起的慢性砷中毒,已成为了国际社会面临的最为严峻的公共卫生问题之一。   饮水型砷中毒是长期饮用高砷水引起的一种慢性砷中毒,也称为地方性砷中毒(Endemic arsenism),临床主要表现为皮肤色素异常、掌趾过度角化,皮肤、肺、膀胱等肿瘤高发,且与高血压、心脑血管病、周围血管病、糖尿病等慢性疾病的发病率升高有关[1]。我国最早20世纪50年代在台湾西南沿海地区发现饮水型砷中毒病区,80年代至今,先后在新疆、内蒙古、山西、宁夏、青海、吉林、黑龙江等12省区发现饮水型地砷病区[2,3]。由此可见,慢性砷中毒正在对人类健康构成严重的威胁,给社会带来巨大的疾病和经济负担。 因而,寻找慢性砷中毒的早期毒作用靶点,探讨砷的毒作用机制显得尤为重要。研究现状及选题依据   摄入体内的砷首先进入血液,其中95%~99%的砷迅速与红细胞血红蛋白结合,再随血流分布和贮存于全身各组织器官,其余的与血浆蛋白结合[4,5]。流行病学调查显示,长期砷暴露人群会产生贫血[6]。动物实验表明,经饮用水砷染毒后大鼠全血RBC计数、红细胞压积及血红蛋白含量下降,WBC计数增加[7]。Ferzand等的研究也证实砷染毒会引起机体血液系统的紊乱[8]。这就提示砷进入人体最早作用并产生毒效应的可能是血液系统。因此,有必要对砷暴露人群血液系统的相关指标进行研究。   砷中毒作用机制尚不明确,目前认为砷进入细胞后可引起细胞内超氧阴离子自由基(﹒O2-)、羟自由基(﹒OH)和过氧化氢(H2O2)等活性氧族(ROS)增多,造成DNA的氧化损伤。近年来的研究表明,砷通过激活细胞质内一氧化氮合酶(NOS)活性,促使过多的一氧化氮(NO)、过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等活性氮族(RNS)生成,导致组织细胞损伤[9]。   8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHdG)是活性氧自由基攻击DNA分子中的鸟嘌呤第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物,它是活性氧基团引起的DNA氧化损伤修饰产物之一。在多种与氧化损伤关系密切的疾病中,均可见8-OHdG水平增高[10]。李昕等发现高砷暴露可引起尿8-OHdG水平增高,且存在明显的剂量-效应关系[11];徐文超等发现长期低砷暴露可引起尿8-OHdG水平增高,且与皮肤损伤程度呈明显正相关[12];但砷暴露对血清8-OHdG的影响研究还少见报道。8-硝基鸟嘌呤(8-Nitroguanine,8-NitroG)是由活性氮族、过氧化亚硝酸阴离子或二氧化氮攻击核酸的产物,可以造成哺乳动物细胞的突变,进一步导致癌变[13]。但国内对此方面的研究极少见报道。研究课题及意义   本研究拟进行流行病学调查采集血液、尿液及日常饮用水样本,检测环境砷及内暴露水平;检测低浓度砷对人群外周血血细胞的一般毒性(血细胞计数仪测外周血血细胞参数);进一步研究其对人群的氧化损伤:检测白细胞中8-OHdG和8-NitroG的分布及表达水平,全面反映低砷对机体整体水平、细胞水平和分子水平的损伤。以期寻找慢性砷中毒的早期毒作用靶点,促进慢性砷中毒的早期预防和有效诊疗,同时为砷的毒作用机制研究开辟一个新的思路。第一部分 低浓度饮水型砷暴露对人群外周血血细胞参数的影响 材料与方法1 研究对象和分组   选择相邻经济发展均衡的山西大同地砷病区和非地砷病区2个自然村,饮水年限20年以上本地居民,无传染性、遗传性等疾病,无放射线和理化致病因素接触史156人为调查对象。其中地砷病区85名为病例组,年龄(59.31±12.65)岁,水砷含量为14.41~90.34 μg/L,检测时尚未改水;非地砷病区71名为对照组,年龄(57.96±7.79)岁,水砷含量为0~0.87 μg/L。平衡病例组和对照组年龄、性别、吸烟、饮酒等因素的影响。2 主要试剂与仪器2.1 主要试剂主要试剂 生产厂家 2.2 主要仪器、器材主要仪器、器材 生产厂家一次性真空EDTA·2Na抗凝采血管 湖南省浏阳市医用仪具厂一次性真空肝素抗凝采血管 湖南省浏阳市医用仪具厂全自动血细胞分析仪 北京科海同业科技发展有限公司 -80℃超低温冰箱 美国Thermo Forma公司3 血样采集及检测3.1 血样采集   选择肘正中静脉,先扎止血带,选择粗且直,弹性好的静脉,松止血带,先碘酒消毒,1分钟后酒精消毒,再扎止血带,以采血针斜面向上,45度角进针,针尖进入血管就平行进针,待针进入血管,即可抽血。将血抽至2ml一次性真空EDTA·2Na抗凝采血管中。3.2 血样检测   用全自动血细胞分析仪及相关原装配套试剂盒定标液,分析测定白细胞(WBC)、淋巴细胞绝对值(LYM)、淋巴细胞百分比(LYM%)、中性粒细胞绝对值(GRA)、中性粒细胞百分比(GRA%)、单核细胞绝对值(MON)、单核细胞百分比(MON%)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血小板(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)和血小板分布宽度(PDW)18个指标的变化情况。血细胞参数的检测严格按照血细胞分析仪的说明书进行。4 统计学分析   所有数据都录入Excel工作表中,然后用SPSS16.0统计分析软件进行分析,计量资料用表示。对所有数据进行正态性和方差齐性检验:服从正态分布,方差齐的,用两独立样本的t检验;服从正态分布,方差不齐的,用两独立样本的t' 检验。所有检验均采用双侧检验,检验水准ɑ=0.05。结论 砷暴露人群的血清8-OHdG含量明显增加;血清8-OHdG的含量与水砷、年龄和尿砷呈正相关;免疫荧光检测显示,砷暴露组人群白细胞中的8-OHdG和8-NitroG含量均增加,且8-OHdG和8-NitroG的表达基本一致。 砷暴露可加剧人群DNA的氧化损伤。 不同皮肤损害程度的砷暴露者DNA氧化损伤的标志物8-OHdG水平有显著差异。 血清8-OHdG可作为DNA氧化损伤的生物学标志物,饮水型砷暴露人群DNA氧化损伤与皮肤损害之间存在一定的关联性。

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