半滑舌鳎星形胶质细胞系的建立与鉴定

鱼类细胞培养始于20世纪60年代。自从1962年， Wolf 和 Quimby首次建立了鱼类细胞系，即虹鳟生殖腺细胞系RTG-2[1]以来，鱼类细胞培养研究发展十分迅速。目前为止, 全世界已报道建立的鱼类细胞系超过有280株, 其中来自淡水鱼或溯河产卵的海洋鱼类细胞系有175株，来源包括 71个科的 89种鱼类；海水鱼类细胞系有100株， 包括23个科的35种海水鱼类提供的不同组织或胚胎。我国鱼类细胞培养起步于20世纪 70年代末[2]。至今已构建大约60株鱼类细胞系。
细胞系相对于动物活体，在实验可重复性以及成本方面具有极大的优势。鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段，被广泛应用在鱼类生理学、免疫学、内分泌学、病理学、遗传育种、病毒学、环境毒理学、肿瘤及基因工程、药物学等多个领域[3-8]。
细胞系的建立方法也有多种，从启动原代培养到传代培养成系，要根据所提取组织的状况，及细胞生长特性科学合理的选择培养手段，鱼类原代培养包括组织块法、酶消化法、机械分离法、悬浮细胞培养法、络合剂分散法和微载体培养法等。目前比较常用的方法是酶消化法、组织块法、络合剂分散法、机械分离法。机械分散法适用于细胞间连接较为松散的组织，如幼鱼全鱼、胚胎，此法利用反复剪切、挤压等物理手段使组织块充分分散，然后收集游离细胞和小组织块进行培养。比如将剪至约1mm3大小的组织块放入底部衬有铜网的注射器内，用力将组织挤出通过网孔，然后就可以收集培养分散的组织。组织块法适用于取材困难，组织量较少时，用无菌眼科剪将组织剪至约1mm3大小的组织块，使其贴在瓶壁上进行培养，细胞会自组织块边缘向外迁移生长。络合剂分散法主要用于囊胚期细胞培养及上皮样细胞的传代，主要利用金属螯合剂EDTA等清除细胞间Ca2+、Mg2+后使细胞间连接松散，铁壁细胞经吹打即可分散，但是缺点是该方法分散细胞效果较差，通常还需要与酶消化液联合使用。酶消化法是目前最为常用的方法，可用于绝大多数组织器官的消化培养，根据其解离组织的程度不同，可将其分成两种：一类是完全消化法，是通过酶消化辅以机械吹打的手段，将组织块最大限度的分散为单个细胞来培养；一类是不完全消化法，即酶作用时间较短，将组织块消化为小组织块和游离细胞的混合产物来进行培养。最常用的组织消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶。这几种酶可单独使用，也可联合使用。常采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化，胰蛋白酶的常用浓度为0.25%-0.5%。胶原酶常用于内含较多结缔组织或胶原成分的较硬的组织的消化。胰蛋白酶消化法可以根据酶消化温度的不同分为冷消化法和热消化法。冷消化法是将组织剪成约2mm3大小的组织块，置于5～10倍体积的胰酶中低温4℃消化过夜；热消化法中酶的作用温度通常是15～20℃，作用时间30～60min。将组织分离进行原代培养是细胞培养的第一步也是最重要的阶段。悬浮培养的对象主要是淋巴细胞及部分肿瘤细胞。
在鱼类细胞培养中，合适的培养基也是决定培养工作成功与否的重要因素，不同鱼类，以及相同鱼类不同组织，适合其生长的培养基也不尽相同。鱼类细胞系常用典型培养基为MEM(Eagle’s Minimum Essential Medium)，L-15(Leibowitz Medium L-15)或M199(Medium 199)，添加剂为10-20%胎牛血清，HEPES 或碳酸氢盐缓冲液。血清能有助于细胞贴壁，能促进细胞生长，是细胞培养中不可缺少的营养成分，细胞初始培养时常用血清浓度为10～20%，继代培养时培养基中血清含量可减少为5～10%。胎牛血清不仅能为细胞生长提供营养补充，促进细胞贴壁，还能保护细胞免受重金属，蛋白酶等物质的损伤。根据需要，有的时候可以添加鱼血清或组织提取物与胎牛血清配合使用，需要注意的是同种鱼的血清对细胞有毒性。此外，应尽可能选用同一批号的胎牛血清，使用前应先置于56℃水浴锅中1h以杀灭支原体，防止支原体污染。鱼类细胞培养常用的盐溶液有磷酸缓冲溶液（PBS）、Hank，s液（HBSS）等。还会向培养液中添加一种或几种促进细胞分裂增殖的生长因子，常见有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子(EGF)，其中bFGF具有强烈促进体外培养细胞增殖的作用，作用浓度一般为2-10ng∕ml。EGF能促进表皮细胞、成纤维细胞等多种细胞的分裂增殖，其作用浓度一般为1-25ng∕ml。为了防止细胞培养过程中由于培养者操作不当引起的细菌交叉污染，还需向培养基中添加适量的抗生素。常用青霉素（100U∕ml）和链霉素（100ug∕ml）来防止细菌污染，两性霉素B(2ug∕ml)可用来防止真菌污染。
原代细胞经过一段时间培养后汇聚成单层，然后就要进行传代培养。用来消化鱼类贴壁生长的细胞所用消化液为0.05%胰酶加0.02%EDTA，酶的作用温度一般为室温。传代细胞经过一段时间的生长，数量急剧上升，此事要做好细胞的保存工作，暂时不用的培养细胞可以用含有冷冻保护剂（二甲基亚砜或者甘油）的培养基进行梯度降温冻存，最终保存于液氮中。原代培养物由多种不同类型细胞构成的，随着传代，生长过程中分裂慢或不分裂的细胞类型逐渐被筛除，不适应培养及成分的细胞也被筛除，生长分裂旺盛的细胞类型逐渐占优势，适应生长的细胞成为培养的主体。大部分细胞系在体外培养过程中存在有限时间段，即约传代50次后，将停止分裂生长而逐渐衰老死亡，这些类型细胞系称为有限细胞系，然而有些细胞系则能通过转化获得永生性，从而在体外长期生存，这些细胞系称为连续性细胞系或永生性细胞系
1.2鱼类细胞培养历史及进展
从20世纪60年代鱼类细胞培养起步至今，其研究范围从建立细胞系，分离病毒发展到进行环境毒理评估，基因功能分析，免疫调控研究，RNA干扰，以及IPS技术等方面的研究，取得阶段性的进展。
20世纪60年代到20世纪80年代，鱼类细胞系的建立工作开始起步。在欧美发达国家，一些淡水及溯河洄游鱼类，如鲑鳟鱼类的细胞系被建立。1962年，美国科学家Wolf 和Quimby建立了虹鳟生殖腺细胞系（RTG-2），发表在《Science》杂志上。1965年，Gravell和Malsberger建立了一个肌肉细胞系（FHM）[9]，此后，剑尾鱼胚胎细胞系SWT、大西洋鲑体内组织细胞系AS[10]等鱼类细胞系相继被建立。这一时期建立了近40株鱼类细胞系[11]。当时细胞系主要应用在水生生物病毒分离与鉴定。
而后的十几年，随着用于细胞培养的鱼类种类及组织来源的增多，鱼类细胞系的建立发展迅速。至1994年，鱼类细胞系数目达159株。我国鱼类细胞培养的研究也有所发展。张念慈和杨广智于1981年用草鱼吻端组织构建了两个细胞株[12]。1986年，左文功等建立了草鱼肾脏组织细胞系CIK[13]。我国台湾学者郭光雄和陈秀男于1988年建立了鳗鲡卵巢细胞系EO-2[14]， 同年，李焕林等建立了草鱼吻端细胞系PSF。1992年，美国学者Collodi等探索研究了斑马鱼胚胎干细胞的分离与培养[15]；1994年，日本学者Wakamatsu等在青鳉中建立了多能性胚胎细胞系[16]。这一时期，世界上有34株海水鱼类细胞系被建立。鱼类细胞系数目的增多，以及跨越结合众多生命科学热门研究领域，使得细胞系作为优良的体外表达体系其应用范围进一步扩大。
新世纪伊始，鱼类细胞培养取得突破性进展：鱼类细胞系数量剧烈增加；细胞培养涉及鱼类的品种大量增加，由鱼类扩展到甲壳类和海产贝类，而且组织来源发展到一些肿瘤细胞和癌细胞；鱼类细胞系的应用范围进一步延伸，已由单纯的病毒分离、毒理学、免疫学、遗传学扩展到近些年研究的基因组学、表观遗传学、基因敲除、RNAi以及iPS等各个方面。
.5.3 环境对鱼类性别分化影响
低等脊椎动物，两栖类、爬行类及鱼类的表型性别是由遗传因素、环境或者社会因素共同决定。温度可以影响大多数鱼类的性别分化[61]。
鱼类性别决定是在受精卵发育成成体过程中，由遗传物质决定分化成雌性还是雄性。然而温度对鱼类性别决定的影响主要表现在鱼类发育的特定阶段，温度对仔鱼的性腺发育产生影响，从而改变鱼类性别分化的方向。鱼类中最早报道的关于环境影响鱼类性别决定影响的例子是月银汉鱼（Menidia menidia），实验发现在不同温度条件下获得的雌雄鱼比例不一样，低温处理的后代中雌鱼偏多。罗非鱼的性别决定主要是由遗传决定的，但其受到环境因子影响时，雌雄后代性别比例发生变化。高温处理尼罗罗非鱼群体，群体中雄鱼比例显著升高，因为部分遗传雌性罗非鱼性反转成为雄性。高温对罗非鱼雄性化的影响主要原因可能是高温干扰了正常雌鱼性别分化发育的过程，促使遗传雌鱼反转为生理雄性；高温还可能参与了雄性化激素的分泌加强。然而对罗非鱼进行低温诱导研究显示，在性腺分化的关键阶段，低温处理仔鱼，性别比例并没有产生显著性差异。对欧洲鲈鱼发育不同阶段进行不同温度诱导结果表明欧洲鲈鱼的性别比例与温度关系密切，高温时鱼群雄性化增强，而在低温时雌性化增强，温度性别的可塑性比较大。邓思平等通过对半滑舌鳎组织学观察发现，饲养条件为控温 24℃下，仔鱼在孵化后 30 天性腺开始分化，具有裂隙的性腺原基发育为卵巢，反之不具裂隙的最后发育为精巢， 30 天左右为半滑舌鳎性别分化的关键阶段，高温可使仔鱼雄性比例升高。
1.6 蛋白转导与蛋白转染对鱼类生理机能产生影响
蛋白进入细胞的途径有多种，包括蛋白转导和蛋白转染。蛋白转导（Protein transduction）就是利用蛋白本身具有的转导结构域将外源蛋白转入细胞的过程。Green 和 Frankel首次发现经过体外重组表达，并且纯化后的 HIV-1 的 TAT 蛋白与细胞进行共同孵化，TAT 蛋白能够自主跨过细胞膜进入细胞，通过其自身在细胞中的正确定位发挥一定的生物活性[62, 63]。接着，Fawell 发现 如果将TAT 结构域与异源蛋白进行结合，异源蛋白可以直接被转入细胞内，这个实验表明 TAT 可能具有转运蛋白的能力，即具有蛋白转导能力。1997 年，Vives 等进一步发现经过剪切的 TAT 蛋白（47-57AA）也同样具有蛋白转导功能，由此说明该区域是蛋白转导结构域[64]。1999 年，Schwarze 等还发现 将TAT 蛋白转导结构域与分子量为116kDa的β-半乳糖苷酶融合后的重组融合蛋白经过腹膜注射法注射小鼠后，发现TAT-β 半乳糖苷酶融合蛋白能够通过血脑屏障，在小鼠的肝、脾、肺、肾、心肌、脑等几乎所有组织中检测到具有活性的融合蛋白的存在[65] 。对于不具备蛋白转导结构域的蛋白，利用蛋白转染载体也能帮助目的蛋白转染进细胞，有学者通过两种手段制备包裹有目的蛋白的阳离子脂质体进行小鼠脾细胞转染，通过免疫荧光，免疫印迹检测，SDS 聚丙烯酰胺的方法检测转染效果，结果发现这两种方法制备的脂质体都能将目的蛋白转染进细胞，且转染效果无显著性差异[66]。蛋白转染将目的蛋白转入细胞主要是通过脂质体法将目的蛋白包裹起来，形成小的颗粒，再通过细胞内吞等生理活动将包裹有目的蛋白的颗粒转进细胞中，但是外来的颗粒在细胞中会被溶酶体消化，所以用脂质体包裹转染蛋白会有部分蛋白被消化，然而没有被消化的脂质体包裹颗粒就会进入细胞质中，释放重组蛋白，被释放的重组蛋白可能会有部分再次被溶酶体消化，剩下的蛋白可能就会参与转染细胞的生理活动。如 Zhou 等利用蛋白转染法将蛋白抗原成功转进 T 淋巴细胞并对其进行诱导[67]。Ignatius 等利用脂质体法包裹卵白蛋白进入 CD8+T 细胞，结果发现在 T 细胞中能检测到卵白蛋白，并且发现 T 细胞产生应答作用，结果表明卵白蛋白通过脂质体包裹法成功进入 T 细胞，并且发挥了一定生物作用。利用原核表达系统构建元和表达载体也是将目的蛋白转入细胞的手段，例如在大肠杆菌中表达携带蛋白转导结构域的 SOX2 等转录因子蛋白，然后将表达的转录因子蛋白与干细胞一起孵化，结果在细胞中检测到转导的目的蛋白，同时干细胞也发现被重组蛋白诱导分化，表明重组蛋白能成功转导进细胞，并发挥生物活性[68]。
半滑舌鳎雌雄鱼生长差异大，雌鱼比雄鱼生长速度快2-3倍，还具有性逆转现象，出现伪雄鱼，即雄鱼生理性别为雄性，具有精巢，但是遗传性别为雌性，具有雌性特异W染色体。随着半滑舌鳎全基因组测序工作的完成，越来越多的性别特异基因被挖掘，利用现代先进的生物技术，这些基因的功能也逐渐清晰，但是性别相关蛋白功能的研究尚属于起步阶段，如果能结合脂质体转染，构建蛋白转导载体等手段将性别相关调控基因产物转入鱼体功能细胞，研究其生物学作用以及其调控机理，对于更好地进行半滑舌鳎育种，阐述其性别决定于性别分化机理都具有重大意义。